從食管癌細(xì)胞系SHEEC中克隆調(diào)控NGAL基因的NF-κB因子的初步研究.pdf

1、近年來,有研究發(fā)現(xiàn)NGAL(neutrophil gelatinase—associated lipocalin)可能是人類的一新的癌基因,在食管上皮細(xì)胞癌變等過程中顯著過表達(dá),但表達(dá)調(diào)控機(jī)制不清。序列分析發(fā)現(xiàn),在NGAL基因5'側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有典型的轉(zhuǎn)錄激活因子NF-kB(nuclear factor kappa B)的結(jié)合元件(GGGAATGTCC,-180~-171bp),提示NF-kB因子可能參與食管上皮細(xì)胞癌變等過程中NGAL

2、基因表達(dá)的調(diào)控。
　　NF-kB是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子家族,目前已從中鑒定出了十幾個(gè)成員,分別在不同的組織或階段,依時(shí)空特異性參與著150余種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,主要涉及免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和耐藥等。那么在食管上皮細(xì)胞癌變等過程中,究竟有哪些NF-kB因子參與作用,其中是否有一些尚未被鑒定的新NF-kB因子存在?為此,本研究通過酵母單雜交等技術(shù)手段在食管癌細(xì)胞cDNA酵母雜交文庫中對NF-kB因子進(jìn)行了初

3、步的篩選與鑒定,以期為闡明NGAL基因在食管上皮細(xì)胞癌變等過程中顯著過表達(dá)提供理論依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容與方法:
　　一、設(shè)計(jì)并合成誘餌片段,定向插入DNA-BD載體,通過限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序的方法鑒定正確重組子。
　　二、將攜帶正確誘餌片段的重組子轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞株YM4271中,通過嚴(yán)格的3-AT抑制試驗(yàn)獲得酵母單雜交宿主細(xì)胞,為篩庫做準(zhǔn)備。
　　三、篩選食管癌細(xì)胞系SHEEC的cDNA酵母雜交文庫,通

4、過反復(fù)營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)和3-AT加壓的方法收獲啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的陽性候選克隆。
　　四、抽提酵母陽性候選克隆的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得單一文庫質(zhì)粒;將純化的單一文庫質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入酵母單雜交宿主細(xì)胞,在酵母體內(nèi)一對一驗(yàn)證激活報(bào)告基因的作用。
　　五、對酵母體內(nèi)一對一驗(yàn)證的陽性克隆進(jìn)行DNA測序。
　　六、對DNA測序結(jié)果進(jìn)行鑒定和初步的生物信息學(xué)分析。
　　研究結(jié)果:
　　一、合成了三重NF-kB位點(diǎn)寡核苷酸串正反

5、鏈,退火后,定向插入DNA-BD載體,篩選鑒定,獲得了攜帶誘餌片段的重組子。
　　二、將攜帶正確誘餌片段的重組子轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞株YM4271中,在嚴(yán)格的3-AT壓力下獲得了基因組上整合有誘餌片段的酵母單雜交宿主細(xì)胞。
　　三、在SHEEC人食管癌細(xì)胞系cDNA酵母雜交文庫中進(jìn)行篩查,獲得了陽性候選克隆351個(gè)。
　　四、對上述陽性候選酵母細(xì)胞克隆進(jìn)行了質(zhì)粒的提取與酶切鑒定,獲得真正插入外源片段的陽性克隆37個(gè)。
　

6、　五、對上述37個(gè)陽性克隆在酵母細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行一對一驗(yàn)證,其中31個(gè)被證實(shí)有激活報(bào)告基因的作用。
　　六、對上述31個(gè)陽性克隆進(jìn)行了DNA測序,并給予鑒定分類;在此基礎(chǔ)上,對部分結(jié)果進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與以往NF-kB因子的p65結(jié)構(gòu)不同。
　　結(jié)論:
　　一、成功建立了酵母單雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺。
　　二、從設(shè)計(jì)合成誘餌片段開始,經(jīng)過誘餌載體構(gòu)建、與宿主酵母菌細(xì)胞染色體整合、篩庫、質(zhì)粒提取與酶切鑒定、酵母

7、細(xì)胞體內(nèi)一對一驗(yàn)證以及DNA測序鑒定分類和初步的生物信息學(xué)分析等,結(jié)果提示,在食管癌細(xì)胞中可能存在著某種結(jié)構(gòu)的NF-kB因子,而且可能是新結(jié)構(gòu)。
　　三、有關(guān)NF-kB因子家族在相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用是一個(gè)復(fù)雜的問題。通過本研究,在食管癌細(xì)胞中針對NGAL基因表達(dá)調(diào)控這一側(cè)面獲得了一些初步結(jié)果。今后擬采取諸如凝膠阻滯等多種實(shí)驗(yàn)手段,圍繞進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果、排除假象開展研究。
　　然而,無論如何,上述結(jié)果所展示出來的實(shí)驗(yàn)事實(shí)都