XIAP在卵巢癌細(xì)胞中調(diào)控NF-κB和cIAP2中的作用.pdf

1、目的：細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，凋亡抑制蛋白是導(dǎo)致化療耐藥的主要原因，在卵巢癌中主要的凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是XIAP、cIAP2和Survivin。核因子(NF-κB)是重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)凋亡抑制蛋白家族(IAPs)成員cIAP2、XIAP等表達(dá)。但是在卵巢癌中XIAP、NF-κB、以及cIAP2三者之間的關(guān)系尚未見報道，本實驗運用RN

2、A干擾技術(shù)沉默卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的XIAP基因后，觀察細(xì)胞凋亡以及cIAP2、NF-κB的變化，探討XIAP表達(dá)水平與cIAP2和NF-κB表達(dá)水平之間的關(guān)系，為卵巢癌的基因治療的策略選擇奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：研究對象為人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3)。(1)針對XIAP的siRNA設(shè)計和選擇。(2)用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌(SKOV-3)細(xì)胞。(3)通過脂質(zhì)體將XIAPFAM-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入卵巢癌(SKO

3、V-3)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分別檢測不同濃度50nmol、100nmol、200nmol的轉(zhuǎn)染率。(4)用轉(zhuǎn)染率最高的轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實驗分組：空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組(XIAP-siRNA)，48小時后收集各組細(xì)胞用MTT法檢測各組細(xì)胞的增值率。(5)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。(6)實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞XIAPmRNA、cIAP2mRNA、NF-κB

4、P65mRNA的相對表達(dá)量。(7)Western Blot檢測各組細(xì)胞XIAP、cIAP2、NF-κB P65蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)XIAPFAM-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測三個濃度50nmol、100nmol、200nmol的轉(zhuǎn)染率分別為50％、51.42％、75.66％。(2)用轉(zhuǎn)染率最高的濃度XIAP-siRNA200nmol轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，48小時后收集各個組的細(xì)胞，MTT法檢測各組卵巢癌細(xì)胞增值率的

5、變化，空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間細(xì)胞增值率分別是100±0、93.00±0.01、93.31±0.02、45.34±0.01，轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組的細(xì)胞增值率明顯低于空白對照組細(xì)胞增值率和脂質(zhì)體組細(xì)胞增值率以及非特異干擾組細(xì)胞增值率，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)。空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間細(xì)胞增值率，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)。(3)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)

6、胞凋亡率，結(jié)果顯示：空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組的凋亡率分別是3.42％、5.12％、6.28％、27.58％。轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組凋亡率明顯高于空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組的凋亡率，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間凋亡率，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)。(4)實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞XIAP mRNA、cIAP2mRNA、NF-κBP

7、65 mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示：空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組的XIAP mRNA相對表達(dá)含量分別為167.38±56.58、163.63±61.06、160.88±38.39、48.78±20.08，轉(zhuǎn)染XIAP-siRNh組XIAP mRNA表達(dá)含量明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組XIAPmRNA表達(dá)含量，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間XI

8、AP mRNA表達(dá)含量，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組的NF-κBPB5mRNA相對表達(dá)含量分別為507.06±111.73、512.75±96.54、488.02±118.42、281.02±71.43，轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組NF-κBP65mRNA表達(dá)含量明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組NF-κBP65mRNA表達(dá)含量，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.

9、05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間NF-κBP65mRNA表達(dá)含量，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組的cIAP2mRNA相對表達(dá)含量分別為242.93±106.05、238.80±88.27、227.76±19.14、129.10±52.95。轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組cIAP2mRNA表達(dá)含量明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組NF-κBP65mRN

10、A表達(dá)含量，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間cIAP2mRNA表達(dá)含量，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)。(5)Western Blot檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá)量結(jié)果：空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組的XIAP蛋白相對表達(dá)含量分別是48.37±1.56、42.56±1.3844.75±1.15、19.28±1.23。轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組XIAP蛋白表達(dá)量明顯

11、低于空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組XIAP蛋白表達(dá)含量，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間XIAP蛋白表達(dá)量，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組NF-κBP65蛋白相對表達(dá)含量分別是9.18±0.23、10.73±0.36、9.12±0.15、3.85±0.10。轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組NF-κBP65蛋白表達(dá)量明顯低于空白

12、對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組NF-κBP65蛋白表達(dá)含量，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)。空白對照組、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間蛋白表達(dá)量，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組、轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組cIAP2蛋白相對表達(dá)含量分別是7.21±0.12、6.95±0.20、6.75±0.11、2.21±0.03。轉(zhuǎn)染XIAP-siRNA組cIAP2蛋白表達(dá)量明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體組、非特

13、異干擾組cIAP2蛋白表達(dá)含量，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)?？瞻讓φ战M、脂質(zhì)體組、非特異干擾組之間cIAP2蛋白表達(dá)量，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)。
　　 結(jié)論：siRNA沉默XIAP后XIAP的表達(dá)量下降，使卵巢癌細(xì)胞(SKOV-3)增殖減少，細(xì)胞凋亡增加。siRNA沉默XIAP后NF-κBmRNA、cIAP2mRNA，蛋白水平的表達(dá)量均減少，可見在卵巢癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá)與cIAP2和NF-κB有聯(lián)系，