AKT2在卵巢癌細(xì)胞NIH-OVCAR-3中對(duì)XIAP、cIAP2調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：近年來(lái)研究表明，PI3K/AKT能經(jīng)過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。凋亡抑制蛋白家族通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)關(guān)于PI3K/AKT和腫瘤凋亡抑制蛋白XIAP、cIAP2三者在卵巢癌中調(diào)控機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染PEGFP-N3-AKT2入經(jīng)紫外線照射10分鐘的卵巢癌細(xì)胞NIH：OVCAR-3中，檢測(cè)各組AKT2、XIAP、cIAP2的mRNA及蛋白表達(dá)情況以及檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡率和增殖率

2、。從而探討PI3K/AKT與XIAP、cIAP2之間的關(guān)系。為卵巢癌基因治療提供新的策略。
　　 方法：研究對(duì)象為人卵巢癌NIH：OVCAR-3細(xì)胞株。(1)構(gòu)建針對(duì)PEGFP-N3-AKT2質(zhì)粒。(2)用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH：OVCAR-3細(xì)胞。(3)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入均接受紫外線照射10分鐘的卵巢癌細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照組(Blank)、空質(zhì)粒組(陰性對(duì)照組)、AKT組(實(shí)驗(yàn)組)。(4)Annexin-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢

3、測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組卵巢癌細(xì)胞NIH：OVCAR-3的凋亡率。(5)MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組卵巢癌細(xì)胞NIH：OVCAR-3的增殖率。(6)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞AKT2 mRNA、XIAP mRNA及cIAP2 mRNA表達(dá)情況。(7)Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞AKT2、XIAP及cIAP2蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)AnnexinV-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞NIH：OVCA

4、R-3早期凋亡結(jié)果顯示：空白組、空質(zhì)粒組、AKT組的凋亡率分別是15.6％、16.53％、5.27％。AKT組凋亡率低于空白對(duì)照組組及空質(zhì)粒組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組之間無(wú)明顯變化(P>0.05)。(2)MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞NIH：OVCAR-3的增殖率：空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組及AKT組細(xì)胞增殖率分別為100％、91.3％、197％，AKT組的OD值比其他兩組高，細(xì)胞的增值率明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

5、5)，空白對(duì)照組與空質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞增值率比較無(wú)明顯變化(P>0.05)。(3)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞中AKT2、XIAP及cIAP2基因mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示：AKT2 mRNA相對(duì)表達(dá)含量空白組為28.0±10.0、空質(zhì)粒組為23.8±5.4、AKT組為482.1±291.3，AKT組比空白組及空質(zhì)粒組的mRNA相對(duì)表達(dá)含量高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白組與空質(zhì)粒組的相對(duì)表達(dá)含量比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0

6、.05)；XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)含量空白組為88.1±30.2、空質(zhì)粒組為84.9±37.3、AKT組為248.6±38.6，AKT組比空白組及空質(zhì)粒組相對(duì)表達(dá)含量高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白組與空質(zhì)粒組的相對(duì)表達(dá)含量比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；cIAP2 mRNA相對(duì)表達(dá)含量空白組為42.4±12.6、空質(zhì)粒組為39.0±4.5、AKT組為270.7±65.9，AKT組比空白組及空質(zhì)粒組相對(duì)表達(dá)含量高，其

7、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白組與空質(zhì)粒組的相對(duì)表達(dá)含量比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各組細(xì)胞中AKT2、XIAP及cIAP2基因蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，AKT蛋白表達(dá)含量空白組為39.85±0.3、空質(zhì)粒組為50.5±2.2、AKT組為105.5±2.6；XIAP蛋白表達(dá)含量空白組為35.05±0.4、空質(zhì)粒組為40.5±1.2、AKT組為73.1±1.5；cIAP2蛋白表達(dá)含

8、量空白組為10.1±0.1、空質(zhì)粒組為11.8±0.6、AKT組為29.6±0.2。AKT組的各個(gè)蛋白含量都較空白組及空質(zhì)粒組的含量高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組各個(gè)蛋白含量比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中，PEGFP-N3-AKT2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染可抑制經(jīng)紫外線照射的卵巢癌細(xì)胞NIH：OVCAR-3的凋亡，同時(shí)轉(zhuǎn)染AKT，上調(diào)AKT后，可使凋亡抑制蛋白XIAP mRNA、cIAP