shRNA誘導(dǎo)BRMS1基因沉默調(diào)控卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女生命健康，死亡率居婦科惡性腫瘤首位，五年生存率僅40％左右。由于其發(fā)病隱匿，早期缺乏特異性癥狀與體征及有效的診斷篩查手段，而且容易出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移，約70%卵巢癌患者確診時多為晚期，失去了手術(shù)的最佳時期，嚴(yán)重影響卵巢癌患者的預(yù)后。究其原因，侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢癌治愈困難的瓶頸所在。因此，目前除了探索卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)的有效手段外，如何有效控制卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移成為提高卵巢癌五年

2、生存率的有效策略，也必將為最終控制卵巢癌提供新的方法，因而，也成為當(dāng)今卵巢癌治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。
　　乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor1，BRMS1）是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，可抑制包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞中已證實(shí)，BRMS1通過抑制趨化因子受體4（chemokine receptor4，CXCR4）和白細(xì)胞介素-6（interleukin

3、-6，IL-6）的表達(dá)以及誘導(dǎo)腫瘤生長抑制因子4（inhibitor of growth4，ING4）的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。但由于其作用復(fù)雜，在卵巢癌中具體的作用機(jī)制尚不清楚。因此，通過研究BRMS1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制，為尋求控制卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)，并為卵巢癌患者的早期診斷、預(yù)后評價和綜合治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　本研究利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建BRMS1-shRNA真核表

4、達(dá)載體并轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞，探討B(tài)RMS1基因沉默對卵巢癌細(xì)胞粘附、侵襲、遷移和血管形成的作用及可能機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.高表達(dá)BRMS1基因的卵巢癌細(xì)胞株的篩選
　　應(yīng)用Western blot法在蛋白水平上檢測4種不同轉(zhuǎn)移潛能人卵巢癌細(xì)胞株ES-2、HO-8910、SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中BRMS1的表達(dá)情況。
　　2. BRMS1真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出沉

5、默效率最高的siRNA靶序列，設(shè)計合成2條互補(bǔ)的靶向 BRMS1寡核苷酸序列，另設(shè)隨機(jī)序列作為陰性對照，退火處理后克隆至pGPU6/GFP/Neo載體，構(gòu)建重組載體BRMS1-shRNA，并通過酶切和測序鑒定。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽性克隆的篩選
　　采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組載體轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞，經(jīng)過G418穩(wěn)定篩選，獲得穩(wěn)定沉默BRMS1基因的卵巢癌細(xì)胞株。采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，采用熒光定量PCR（Q-PCR）和West

6、ern blot法分別從 mRNA和蛋白水平檢測BRMS1的表達(dá)。
　　4.沉默BRMS1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞轉(zhuǎn)移行為的影響
　　采用黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的黏附能力，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的體外侵襲能力，采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的體外遷移能力，采用體外血管形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的誘導(dǎo)體外血管形成能力。
　　5. BRMS1影響卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　采用熒光定量 PCR法檢測

7、CXCR4 mRNA的表達(dá)，采用Western blot法檢測CXCR4、ING4和IL-6蛋白的表達(dá)，初步確定BRMS1基因沉默對細(xì)胞轉(zhuǎn)移調(diào)控的分子機(jī)制；進(jìn)一步采用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）探討B(tài)RMS1基因沉默對核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κappaB，NF-κB）蛋白與 CXCR4啟動子結(jié)合能力的影響，從而研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析。

8、計量資料以`c±s表示，三組間比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.成功篩選出高表達(dá)BRMS1的卵巢癌細(xì)胞株：OVCAR3。
　　2.重組載體BRMS1-shRNA經(jīng)酶切鑒定可以被BamHⅠ切開，位點(diǎn)正確，而不能被PstⅠ切開，進(jìn)一步測序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計合成的pGPU6/GFP/Neo-BRMS1靶向目標(biāo)序列完全一致，成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-BRMS1重組質(zhì)粒。<

9、br>　　3. BRMS1-shRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌OVCAR3細(xì)胞，經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后，Q-PCR和Western blot檢測顯示，干擾組細(xì)胞中 BRMS1-mRNA和蛋白表達(dá)抑制率分別為85.15%和46.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默BRMS1基因的卵巢癌細(xì)胞株。
　　4. BRMS1-shRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，體外粘附、侵襲、遷移和誘導(dǎo)血管形成能力較對照組明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.

10、05）。
　　5. BRMS1-shRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，Q-PCR結(jié)果顯示，CXCR4 mRNA表達(dá)上調(diào)，是空白對照組的1.78倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，CXCR4和IL-6蛋白在干擾組中表達(dá)上調(diào)，分別是對照組的1.26倍和1.5倍，而ING4蛋白表達(dá)下降，抑制率為30%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　6. EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OVCAR3細(xì)胞中NF-κB蛋白能與CX

11、CR4基因啟動子區(qū)的DNA結(jié)合，BRMS1-shRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后CXCR4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建BRMS1-shRNA真核表達(dá)載體，可穩(wěn)定抑制人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中BRMS1基因的表達(dá)。
　　2.沉默 BRMS1基因的表達(dá)可明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的粘附、侵襲、遷移和誘導(dǎo)血管形成能力。
　　3. BRMS1沉默后，CXCR4和IL-6的表達(dá)上調(diào)，而ING4表達(dá)下調(diào)，由此推測上