乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1功能的研究.pdf

1、目的：研究乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1對乳癌細(xì)胞生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及輻射敏感性的影響以及涉及的相關(guān)作用機(jī)制，為研究乳癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移和治療提供新的研究方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、參照GeneBank中BRMS1的基因序列，通過自行設(shè)計并擴(kuò)增得到BRMS1基因cDNA的引物一對，構(gòu)建了攜帶有全長BRMS1 cDNA的真核表達(dá)載體（pcDNA3-BRMS1）；
　　 2、應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體L

2、ipofactamin2000介導(dǎo)，進(jìn)行pcDNA3-BRMS1轉(zhuǎn)染，陽性克隆通過在含G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選得到，并應(yīng)用RT-PCR和Western Blot法檢測陽性克隆中BRMS1的mRNA和蛋白的表達(dá)；
　　 3、應(yīng)用MTT法分析BRMS1基因轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的乳癌細(xì)胞生長、增殖的影響；
　　 4、應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden小室法，分析BRMS1基因轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的乳癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響；
　　

3、 5、采用流式細(xì)胞術(shù)分析BRMS1基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡的影響；
　　 6、采用裸鼠原位接種腫瘤模型，觀察BRMS1基因在體內(nèi)對乳癌生長、轉(zhuǎn)移的影響；
　　 7、采用裸鼠尾靜脈接種腫瘤轉(zhuǎn)移模型觀察BRMS1基因?qū)w內(nèi)乳癌轉(zhuǎn)移的影響；
　　 8、通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分析BRMS1基因?qū)θ榘┘?xì)胞輻射敏感性的影響；
　　 9、采用染色體畸變分析、PCC斷片研究BRMS1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞基因組不

4、穩(wěn)定性的影響；
　　 10、采用Western Blot法檢測BRMS1基因?qū)NA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響；
　　 11、采用GST-pull down和免疫共沉淀方法檢測BRMS1與核受體直接結(jié)合；
　　 12、采用熒光素酶報告基因測定方法測定轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)果：
　　 1、自行構(gòu)建的BRMS1真核表達(dá)載體，經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切后電泳和擴(kuò)增片斷測序，證實(shí)載

5、體構(gòu)建成功；
　　 2、G418篩選得到的穩(wěn)定陽性克隆，經(jīng)RT-PCR和Western Blot證實(shí)，轉(zhuǎn)染BRMS1基因可以在乳癌細(xì)胞中提高BRMS的表達(dá)水平，表明高BRMS1表達(dá)的細(xì)胞株篩選成功；
　　 3、MTT的結(jié)果表明BRMS1對乳癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的生長無明顯影響；
　　 4、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BRMS1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435體外遷移能力無

6、明顯影響；
　　 5、Boyden小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：BRMS1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穿越細(xì)胞數(shù)與未轉(zhuǎn)染組相比顯著減少（p＜0.05），BRMS1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穿越細(xì)胞數(shù)與空載體組相比也顯著減少（p＜0.05）；
　　 6、流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明：BRMS1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的周期分布及凋亡無明顯改變；
　　 7、裸鼠原位接種腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：BRMS1基因?qū)β闶蟮捏w重及腫瘤的生長速

7、度及腫瘤大小無明顯影響；BRMS1基因轉(zhuǎn)染組的原位腫瘤分化程度較高，而惡性程度偏低；
　　 8、腫瘤轉(zhuǎn)移模型觀察：未轉(zhuǎn)染對照組裸鼠有5例明顯的肺轉(zhuǎn)移，5例出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)染空載體組裸鼠也出現(xiàn)5例肺轉(zhuǎn)移,4例肝轉(zhuǎn)移，而BRMS1轉(zhuǎn)基因裸鼠組只有1例出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。表明體內(nèi)BRMS1高表達(dá)能抑制乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移；
　　 9、腫瘤組織血管實(shí)驗(yàn)：與未轉(zhuǎn)染組比較，BRMS1轉(zhuǎn)基因組裸鼠的腫瘤血管數(shù)目較少，有顯著統(tǒng)計差異(P<0.05)，

8、表明BRMS1基因能抑制乳腺癌血管生成；
　　 10、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果：BRMS1轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組及空載體組的生存曲線基本一致，表明BRMS1基因不影響腫瘤細(xì)胞受照射后的存活率；
　　 11、染色體畸變分析、PCC斷片分析結(jié)果：不同劑量的X射線照射后，BRMS1轉(zhuǎn)染組的染色體畸變率及PCC斷片率低于空載體組與未轉(zhuǎn)染組；
　　 12、Western Blot法檢測DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)，BRMS1基因?qū)椛湫迯?fù)

9、相關(guān)蛋白FEN-1、XRCC1和Ku-70的表達(dá)無明顯影響；
　　 13、BRMS1可以與雄激素，雌激素等多種核受體蛋白結(jié)合，同時作為協(xié)同抑制因子抑制AR和ER-a的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)論：
　　 1、在體外實(shí)驗(yàn)中，BRMS1基因通過降低腫瘤癌細(xì)胞的侵襲能力而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；BRMS1基因不影響乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-435的增殖能力、遷移和轉(zhuǎn)移能力；不影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布與凋

10、亡；
　　 2、BRMS1基因不影響裸鼠原位移植腫瘤的形成及腫瘤細(xì)胞本身的生長；BRMS1基因通過抑制移植腫瘤的血管生成及促進(jìn)體內(nèi)移植腫瘤的分化，從而降低腫瘤的惡性程度，抑制裸鼠移植腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；
　　 3、BRMS1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞受照射后的存活率無明顯影響；不影響腫瘤細(xì)胞受照前后相關(guān)輻射損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)。BRMS1基因通過降低腫瘤細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性而在一定程度上降低了腫瘤細(xì)胞的放射敏感性；
　　 4、BR