卵巢癌細胞系OVCAR-3中側(cè)群細胞的分離鑒定及生物學特性的研究.pdf

1、背景與目的:卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率居于第三位的惡性腫瘤,僅次于子宮頸癌和子宮體癌,但卵巢癌的病死率是所有婦科腫瘤中最高的。其臨床癥狀不典型,發(fā)病部位隱蔽,易于轉(zhuǎn)移及廣泛播散。卵巢癌進行剖腹探查術中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占30％,大多數(shù)己擴散到子宮雙側(cè)附件,大網(wǎng)膜及盆腔各器官,所以至今卵巢癌在診斷和治療上仍是一大難題,而且治療后極易復發(fā)。經(jīng)以手術為主的綜合治療以后5年存活率仍然徘徊在30％左右。這一狀況

2、近十年來未能改善,對婦女生命造成嚴重威脅,因此探索新的治療策略顯得極為迫切。
　　 近年來隨著對腫瘤研究的不斷深入,逐漸形成了腫瘤干細胞理論。人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中也存在等級現(xiàn)象,并且認識到僅少量腫瘤細胞在惡性腫瘤發(fā)展過程中起到干細胞作用,它們具有不斷地自我更新和分化的能力,可以維持惡性腫瘤組織的不斷生長和轉(zhuǎn)移,還可以分化成各種腫瘤細胞和非腫瘤細胞。但是腫瘤組織中其余大部分細胞在經(jīng)過短暫的分化后,即便沒有化療藥物的作用也會最終走向凋

3、亡或死亡。
　　 目前對腫瘤干細胞的研究越來越多,并在多種實體腫瘤中證實了腫瘤干細胞的存在。卵巢癌干細胞的研究對認識卵巢癌的發(fā)病機制、早期診斷以及根治方法提示了新的研究方向。
　　 分離和鑒定腫瘤干細胞是研究腫瘤干細胞的首要問題,但是如果缺乏特異的表面標記物,腫瘤干細胞的分離鑒定就變成一個難題。側(cè)群細胞(Sidepopulation cell,SP cell,SP細胞)是利用DNA熒光染料Hoechst33342和流式細

4、胞技術發(fā)現(xiàn)的特殊細胞亞群,能通過.ABC轉(zhuǎn)運蛋白將熒光染料Hoechst33342泵出細胞而呈弱染狀態(tài),并因此而得名。側(cè)群細胞可能是一種特殊類型的干細胞,具有自我更新、多向分化等一系列干細胞的生物學特征。至今人們已經(jīng)在多種實體腫瘤中分離得到了側(cè)群細胞。當缺乏干細胞特異標記的情況下,SP細胞分選和分析成為研究腫瘤干細胞的一種實用而重要的方法。
　　 最近的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞的另一重要特征是它們具有間質(zhì)細胞的特性,它們?nèi)菀壮霈F(xiàn)表皮

5、細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)。EMT現(xiàn)象是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的第一步,也是最重要的一步。阻斷腫瘤干細胞的EMT特性,有可能預防腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 本研究利用SP細胞的弱染特性將OVCAR-3細胞系中的SP細胞分選出來,并對其生物學特性進行研究,為探索以腫瘤干細胞理論為基礎的新的卵巢癌治療策略提供實驗依據(jù)。
　　 方法:本研究中,首先用免疫細

6、胞化學方法分析了干細胞相關基因Oct3／4在OVCAR-3細胞中的表達。隨后將生長狀態(tài)良好的OVCAR-3細胞經(jīng)Hoechst33342染色后進行流式細胞儀分選,通過對Hoechst33342濃度和染色時間的調(diào)整對SP方法進行條件優(yōu)化。對比維拉帕米抑制實驗在流式細胞儀上設門,分別收集熒光陽性的NSP細胞和熒光陰性的SP細胞,研究它們生物學性狀的差異,包括將分選后的兩個亞群的細胞分別接種到六孔板中,進行克隆形成實驗,比較兩個亞群細胞克隆形

7、成能力是否存在差異:分別提取兩個亞群細胞的總RNA,進行real-time PCR,比較兩個亞群細胞中干細胞相關基因Oct3／4和EMT相關基因Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等的表達差異；用無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)分選的SP細胞和NSP細胞,觀察它們的形態(tài)變化；用不同劑量的X射線照射分選的SP細胞和NSP細胞,比較其對X射線的抵抗能力。
　　 結(jié)果:免疫細胞化學結(jié)果顯示,OVCAR-3細胞系中的一小群細

8、胞表達Oct3／4蛋白,但與陽性對照精原細胞癌中Oct3／4蛋白的表達相比,OVCAR-3細胞中Oct3／4蛋白的表達非常微弱。
　　 進行流式細胞分選時,當應用5μg／ml的Hoechst33342對卵巢癌細胞系OVCAR-3進行染色分析,結(jié)果重復數(shù)次均未發(fā)現(xiàn)SP細胞。當應用2.5μg／ml的Hoechst33342染色,37℃9陣育90min后上機分析,結(jié)果OVCAR-3細胞中出現(xiàn)了0.1％的SP細胞,且SP細胞經(jīng)維拉帕米作

9、用后數(shù)量減少或者消失。當應用1μg／ml的Hoechst33342染色,37℃孵育90min后上機分析,發(fā)現(xiàn)沒有明顯的SP細胞出現(xiàn)。
　　 隨后我們以不同的孵育時間與不同濃度的Hoechst33342相組合進行分析,最終發(fā)現(xiàn),當應用2.5μg／ml的Hoechst33342染色染色60min,對照管中加入100μM的維拉帕米,37℃孵育60min后上機分析時,結(jié)合維拉帕米抑制試驗,在OVCAR-3細胞系中設門,SP細胞最明顯,比

10、例為0.9％。隨后SP細胞和NSP細胞被分選出來用于后續(xù)實驗。
　　 克隆形成實驗顯示,分選出的細胞培養(yǎng)12天之后,形成的大部分克隆的細胞數(shù)能達到50個以上,SP細胞的克隆形成能力遠遠高于NSP細胞,克隆形成率分別為(19.8±4.1)％和(3±1.3)％(P<0.01)。顯微鏡下見SP細胞有3種類型的克隆形成:Holoclones(形成克隆的細胞排列緊密,細胞直徑較小,克隆直徑最大)、Paraclone(形成克隆的細胞疏散分布

11、,細胞直徑較大,克隆直徑較小)和Metoclone(介于Holoclone和Paraclone之間的克隆)。只有SP細胞能夠形成Holoclones,NSP細胞僅能形成幾個Paraclone和Metoclone。
　　 無血清細胞培養(yǎng)實驗顯示分選的SP細胞和NSP細胞培養(yǎng)5天后,SP細胞表現(xiàn)出了明顯的間質(zhì)細胞特性,具體表現(xiàn)為細胞形態(tài)大部分明顯拉長,呈明顯的成纖維細胞形態(tài),而NSP細胞的形態(tài)變化不明顯。
　　 Real-t

12、ime RT-PCR研究發(fā)現(xiàn),SP細胞與分選出的NSP細胞相比,Oct3／4表達更高(P<0.05)。并且與細胞形態(tài)變化相一致,SP細胞的N—cadherin和VemintinRNA的表達更高(P<0.05),而NSP細胞的E-cadherin RNA表達更高(P<0.05)。
　　 X射線照射敏感性檢測結(jié)果顯示,SP細胞對X射線照射的抵抗能力明顯強于NSP細胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.人卵巢癌細胞系OVCAR