XIAP在肝癌組織的異常表達(dá)及對肝癌細(xì)胞調(diào)控的研究.pdf

1、肝癌，作為世界上第五種常見的惡性腫瘤，高居癌癥致死原因中的第三位，占據(jù)成人肝臟惡性腫瘤的80％]。它的五年存活率是7％，每年可導(dǎo)致將近600，000人死亡。雖然非洲和亞洲是肝癌的高發(fā)地，但是近些年在西方國家由于酒精性肝炎和HCV感染的增多，肝癌的發(fā)病率也在逐年上升。肝癌有幾種常見的流行病學(xué)特征：發(fā)病趨勢的動態(tài)性，基因突變區(qū)域的多樣性，種族和人群的差異，男性和女性發(fā)病率的差異，幾種常見的環(huán)境危險因子。 肝癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的建立，作為

2、一項新的研究成果，已經(jīng)為肝癌病人的診斷和預(yù)后提供了很好的平臺。如我們所期望的那樣，基于基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)建立的生物模型，能夠精確的區(qū)分肝癌組織和非肝癌組織。依據(jù)病因因子、腫瘤抑制基因的變異、復(fù)發(fā)率、肝功能代謝、腫瘤分期，不同的肝癌基因表達(dá)已經(jīng)被確認(rèn)。但是，大多數(shù)這些研究只是涉及了肝癌基因表達(dá)的某些側(cè)面，沒有反映觸發(fā)腫瘤形成的本質(zhì)的生物學(xué)特性。這是因為mRNA水平不能精確地反映蛋白分子水平，也不能反映病因?qū)W分子轉(zhuǎn)錄水平上的蛋白質(zhì)改變和蛋白質(zhì)分子

3、降解水平上的改變。因此，分析腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞間的蛋白質(zhì)分子水平的改變，對于進(jìn)一步完善肝癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)就顯得非常的重要。PathwayArray技術(shù)作為一項創(chuàng)新性的技術(shù)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子進(jìn)行大規(guī)模的篩選。此項技術(shù)主要是應(yīng)用于研究與腫瘤發(fā)展(發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移)相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白分子與血管生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖、信號傳導(dǎo)、干細(xì)胞的分化都具有功能上的相關(guān)性。本課題主要是應(yīng)用此項技術(shù)研究肝癌

4、組織和肝癌細(xì)胞當(dāng)中的蛋白質(zhì)分子表達(dá)水平。 肝癌作為慢性肝損傷的晚期階段，以肝小葉周邊多核肝癌細(xì)胞的浸潤性生長和毗鄰細(xì)胞凋亡抑制為主要特征。凋亡的抑制對于經(jīng)受基因損傷和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變后的肝細(xì)胞的存活具有非常重要的作用，它們可以通過細(xì)胞的再生而保持高速的增殖。事實上，肝癌細(xì)胞對于各種誘導(dǎo)凋亡的刺激都保持著很強(qiáng)的耐受性。但是，目前對于肝癌細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制的研究還不是很清楚。 最近的許多研究表明，凋亡抑制子(IAP)在凋亡的分子

5、調(diào)節(jié)機(jī)制中起著非常重要的作用。到目前為止，6種人類IAP蛋白，即XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、survivin和Apollon都已經(jīng)得到證實。它們通常有1-3個由70個氨基酸組成的模體和一個BIR結(jié)構(gòu)域；而其BIR結(jié)構(gòu)域與桿狀病毒IAP蛋白序列具有高度的同源性，在與caspases結(jié)合及抑制caspases作用方面，特別是caspases3和caspases7，具有非常重要的作用。另外，c-IAP1和c-IAP2在酵母

6、雙雜交系統(tǒng)中可以與TRAF-1和TRAF-2相結(jié)合；這就表明c-IAP1和c-IAP2可以通過TRAF參與TNF誘導(dǎo)的NF-κB激活的調(diào)節(jié)。XIAP蛋白包含有3個BIR結(jié)構(gòu)域和1個環(huán)形指狀結(jié)構(gòu)域，與c-IAP1和c-IAP2相比，它具有更強(qiáng)的抑制caspase3和caspases7的作用[44-46]。XIAP的mRNA表達(dá)水平在除外周血淋巴組織外幾乎所有的人類組織當(dāng)中都得到了檢測，這說明XIAP作為IAP家族的成員之一，是其中最具代表

7、性的一種。但是，關(guān)于XIAP在肝癌組織當(dāng)中的蛋白表達(dá)水平和其在肝癌細(xì)胞調(diào)控方面的研究卻很少。 目的：將利用pathwayarray技術(shù)檢測XIAP在肝癌組織當(dāng)中的表達(dá)水平，同時在體外進(jìn)行肝癌細(xì)胞的XIAP小分子RNA干擾研究，觀察在特異性基因表達(dá)被敲低后，對肝癌腫瘤細(xì)胞增殖、周期、凋亡和其它蛋白質(zhì)表達(dá)的影響情況；從而更深一步明確其在肝癌發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)方面的作用。 方法：1、收集13個肝癌病人的組織標(biāo)本，包括肝癌組織和肝

8、癌旁正常組織，進(jìn)行pathwayarray實驗，研究其組織當(dāng)中的蛋白質(zhì)分子表達(dá)水平；2、根據(jù)pathwayarray結(jié)果，選取XIAP作為切入點(diǎn)，利用小分子RNA干擾技術(shù)，特異性敲低XIAP在hepG2/2.2.1(humanhepatocellularcarcinoma)細(xì)胞株中的基因表達(dá)水平，通過RT-PCR技術(shù)證實其表達(dá)情況；3、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行cellviabilityanalysis，研究XIAP在肝癌細(xì)胞增

9、殖方面的作用；4、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行cellcycleanalysis，研究XIAP在肝癌細(xì)胞周期方面的作用；5、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行cellapoptosisanalysis，研究XIAP在肝癌細(xì)胞凋亡方面的作用；6、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行pathwayarray實驗，研究XIAP基因表達(dá)敲低后，對肝癌細(xì)胞中其它蛋白質(zhì)分子表達(dá)的影響情況。 結(jié)果：1、13對標(biāo)本當(dāng)中，每對標(biāo)本我們都雜交了

10、44種磷酸化和非磷酸化蛋白，共檢測到23種蛋白，其中存在兩倍以上變化的蛋白有22種，其中XIAP、BRCA1、PCNA在肝癌組織中明顯的高表達(dá)；2、在XIAPsiRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)hepG2/2.2.1細(xì)胞株后，通過RT-PCR技術(shù)，檢測到肝癌細(xì)胞當(dāng)中的XIAP基因表達(dá)水平被明顯敲低；3、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，與對照組相比較，實驗組中肝癌細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，故證明XIAP有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用；4、XIAPsiRNA成功

11、轉(zhuǎn)染后，與對照組相比較，XIAPsiRNA實驗組出現(xiàn)了G1arrest，證明XIAP也參與肝癌細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)；5、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，與對照組比較，XIAPsiRNA實驗組出現(xiàn)了較多壞死細(xì)胞，證明XIAP也參與肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)；6、XIAPsiRNA成功轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行pathwayarray分析，我們雜交了66種磷酸化和非磷酸化蛋白，共檢測到26種蛋白，其中存在兩倍以上變化的蛋白有6種。XIAP可以下調(diào)ETS1的表達(dá)，同時可以