焦點(diǎn)粘附激酶在肝癌中表達(dá)及其對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97-H作用的研究.pdf

1、侵襲轉(zhuǎn)移是影響原發(fā)性肝癌預(yù)后的最重要因素。焦點(diǎn)粘附激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)在許多腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但FAK與腫瘤預(yù)后的關(guān)系尚有爭(zhēng)議。FAK介導(dǎo)以整合素為主的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，機(jī)制復(fù)雜。既然FAK表達(dá)與腫瘤關(guān)系密切，那FAK是否可作為原發(fā)性肝癌的治療靶點(diǎn)?RNAi技術(shù)是后基因時(shí)代研究基因功能的重要方法之一。本研究旨在探討FAK在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其在判斷預(yù)后中的作用，并研究了上調(diào)FAK后對(duì)人

2、肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響；最后，利用RNAi技術(shù)抑制FAK表達(dá)以判斷FAK是否能成為原發(fā)性肝癌治療靶點(diǎn)。 第一部分 目的：研究焦點(diǎn)粘附激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)在不同肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)差異及FAK表達(dá)在判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后中的意義。方法：回顧性分析了我所50例肝細(xì)胞癌患者臨床資料。用Real-timePCR方法檢測(cè)肝癌組織、癌周組織和癌栓組織中FAKmRNA表達(dá)，免疫組化和Western-blot方

3、法檢測(cè)FAK蛋白在不同組織中表達(dá)和分布；分析FAKmRNA表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理指標(biāo)關(guān)系；單因素與Cox回歸分析FAK與肝癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：FAKmRNA表達(dá)在腫瘤組織中為0．229~0．027，明顯高于癌周組織的0．163~0．019，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．001)；癌栓組中癌栓組織FAKmRNA表達(dá)水平為0．506~0．155，高于腫瘤組織的O．377_--90．176，且差別有顯著性意義(P

4、AKmRNA表達(dá)0．3434-0．05，明顯高于無癌栓組中腫瘤組織的0．165~0．025，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P：O．003)；合并肝硬化的癌周組織相對(duì)FAK表達(dá)為O．1914-0．029，高于無肝硬化癌周組織的0．141__．0．034，但差別無顯著性(P>0．05)。高侵襲組中腫瘤組織FAKmRNA表達(dá)明顯高于低侵襲組(0．2834-0．038vs0．161±0．032，P=O．020)。免疫組化結(jié)果示FAK蛋白位于胞漿中，陽性率

5、為50％；Western-blot結(jié)果提示癌栓中FAK蛋白表達(dá)高于癌組織，而癌組織表達(dá)高于癌周組織。FAKmRNA表達(dá)與癌栓和侵襲性有關(guān)。單因素與Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)是影響肝細(xì)胞癌術(shù)后生存率的獨(dú)立因素。結(jié)論：FAK在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，F(xiàn)AK表達(dá)是判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。 第二部分 目的：觀察不同濃度血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)誘導(dǎo)MHCC97-H細(xì)胞中焦點(diǎn)粘附激酶(focaladhe

6、sionkinaseFAK)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及FAK變化對(duì)MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響。方法：不同濃度(1，2．5，5，10，25ng/m1)PDGF-BB誘導(dǎo)MHCC9-H人肝癌細(xì)胞，用Real—timeRTPCR方法檢測(cè)FAK及MMP-2的mRNA動(dòng)態(tài)變化，Western-blot方法檢測(cè)誘導(dǎo)后FAK蛋白表達(dá)變化。粘附實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)誘導(dǎo)后MHCC97-H細(xì)胞的粘附、侵襲能力的變化。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ABC-ELISA)和

7、明膠酶譜試驗(yàn)檢測(cè)PDGF-BB誘導(dǎo)后MHCC97-H分泌MMPs變化。激光共聚焦顯微鏡觀察PDGF誘導(dǎo)后MHCC97-H細(xì)胞骨架重塑變化。結(jié)果：誘導(dǎo)后MHCC97一H細(xì)胞FAKmRNA水平均有不同程度上調(diào)，在long/m1濃度時(shí)達(dá)到最高，為對(duì)照組的112．6倍；誘導(dǎo)后MMP-2mRNA水平亦有不同程度上調(diào)并與FAKmRNA水平上調(diào)呈一致性，在long/m1濃度時(shí)到最高，為對(duì)照組的56．9倍。誘導(dǎo)后FAK蛋白表達(dá)上調(diào)，在long/ml組達(dá)

8、到高峰。誘導(dǎo)后各組粘附率分別為66±L84％、69±1．41％、69±2．42％、71±1．37％和66±3．28％，與對(duì)照組的54±2．08％比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．001)。誘導(dǎo)后5ng向1和10ng／ml組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為26．63±L67和28．75±1．50個(gè)，與對(duì)照組的2L5±4．0個(gè)比較有顯著性差異(P

9、MMPs明顯增加。PDGF-BB誘導(dǎo)5分鐘后見絲狀偽足，15分鐘后見板狀偽足，30分鐘后見明顯粘著斑。結(jié)論：PDGF-BB上調(diào)MHCC97-H細(xì)胞中FAK表達(dá)，F(xiàn)AK上調(diào)通過細(xì)胞骨架重塑和增加MMP-2分泌而促進(jìn)MHCC97-H細(xì)胞的粘附和侵襲能力。 第三部分 目的：研究特異性FAKsiRNA抑制焦點(diǎn)粘附激酶(FAK)表達(dá)對(duì)MHCC97-H細(xì)胞粘附、侵襲和細(xì)胞骨架重塑中的作用。方法：利用Lipofectamine2000

10、將FAKsiRNA轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細(xì)胞。用Real-timePCR和Western-blot方法分別檢測(cè)RNAi后MI-ICC97-H細(xì)胞中FAK表達(dá)。粘附實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)RNAi后MHCC97-H細(xì)胞粘附、侵襲能力變化。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ABC-ELISA)和明膠酶譜試驗(yàn)檢測(cè)RNAi后MHCC97-H細(xì)胞分泌MMPs變化。激光共聚焦顯微鏡觀察FAK抑制后免疫熒光標(biāo)記MHCC97-H細(xì)胞骨架構(gòu)建變化。結(jié)果：特異性FAKsiR

11、NA在mRNA和蛋白水平均能明顯抑制MHCC97-H細(xì)胞中FAK表達(dá)，陰性對(duì)照siRNA不能抑制FAK表達(dá)。RNAi作用減少M(fèi)HCC97-H細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，干擾后粘附率為35．8％，低于對(duì)照組的57．3％，差異有顯著性(P<0．05)。與正常組的3L3±2．6個(gè)細(xì)胞相比，抑制FAK后MHCC97-H細(xì)胞穿透Tanswell小室的數(shù)目減少到M．5±3．1個(gè)(P<0．05)。FAKsiRNA抑制FAK后能顯著性降低MHCC97-H細(xì)胞