8-溴-7-甲氧基白楊素對MHCC97-H細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞特性和β-catenin表達(dá)的影響.pdf

1、目的:研究8-溴-7-甲氧基白楊素(8-bromo-7-methoxychrysin，BrMC)對MHCC97-H細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞(livercancerstemcells，LCSCs)特性和β-catenin表達(dá)的影響，并探討B(tài)rMC抑制LCSCs特性作用是否依賴于調(diào)控β-catenin蛋白表達(dá)。
　　方法:免疫磁球分選法(MagneticActivatedCellSorting，MACS)從人肝癌MHCC97-H細(xì)胞系中分選C

2、D133+細(xì)胞;用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基超低粘附板培養(yǎng)富集并擴增CD133+球形成細(xì)胞(sphereformingcells，SFCs)即LCSCs。藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記CD133熒光抗體流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測CD133+細(xì)胞百分率;腫瘤球傳代培養(yǎng)和有限稀釋法比較LCSCs和親本細(xì)胞自我更新能力;Westernblot對比分析LCSCs和親本細(xì)胞CD133、CD44、E-cadheri

3、n、ZO-1;N-cadherin、vimentin、β-catenin蛋白表達(dá)水平。建立體內(nèi)裸鼠異種移植模型，比較LCSCs和親本細(xì)胞的致瘤性。不同濃度BrMC處理LCSCs，MTT比色法測定增殖活性、倒置顯微鏡下觀察LCSCs單層貼壁生長形態(tài)、腫瘤球形成試驗評價自我更新能力、Matrigel體外細(xì)胞侵襲試驗檢測體外細(xì)胞侵襲能力、Westernblot分析CD133、CD44、E-cadherin、ZO-1、N-cadherin、vi

4、mentin和β-catenin蛋白表達(dá)。建立Balb/c-nu小鼠原代和再次接種異種移植模型，分析BrMC體內(nèi)靶向抑制或根除LCSCs作用。通過β-catenin特異性小干擾RNA(SmallinterferingRNA，siRNA)轉(zhuǎn)染和Wnt3a條件培養(yǎng)基處理LCSCs，檢測BrMC對LCSCs細(xì)胞β-catenin、CD133、CD44表達(dá)和腫瘤球形成能力影響。
　　結(jié)果:PE標(biāo)記CD133熒光抗體FCM分析結(jié)果顯示:免疫

5、磁球分選得到較純CD133+細(xì)胞亞群(CD133+細(xì)胞群:57.29±4.61％，CD133-細(xì)胞群1.02±0.65％，親本細(xì)胞群:7.21±1.34％)。超低粘附板培養(yǎng)6天，CD133+細(xì)胞和親本細(xì)胞能在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中形成腫瘤球，但是CD133+細(xì)胞腫瘤球形成能力更強（球數(shù)目:CD133+細(xì)胞:167±31vs親本細(xì)胞:61±26;球體積:CD133+細(xì)胞:397±45μm3vs親本細(xì)胞:153±31μm3)(P＜0.05)，C

6、D133-細(xì)胞不能成球。腫瘤球傳代培養(yǎng)結(jié)果顯示，CD133+SFCs能夠傳代成球生長。有限稀釋法結(jié)果表明，單個CD133+SFCs能形成新的腫瘤球。Westernblot分析結(jié)果顯示，SFCs高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133和CD44)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-cadherin和Vimentin)和β-catenin蛋白，并低表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin和ZO-1)。倒置顯微鏡下觀察到單層貼壁生長的CD133+SFCs呈梭形，而

7、親本細(xì)胞則呈鵝卵石樣形態(tài);Matrigel體外細(xì)胞侵襲試驗發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞相比，CD133+SFCs具有更高的體外侵襲能力。裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果表明，CD133+SFCs具有高致瘤性，并觀察到CD133+SFCs移植瘤和親本細(xì)胞移植瘤具有相似的組織學(xué)形態(tài)，但是，CD133+SFCs裸鼠皮下移植瘤組織高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44蛋白。MTT測定結(jié)果證明，BrMC以濃度依賴方式優(yōu)先抑制LCSCs的增殖活性(P＜0.05)，BrMC

8、對LCSCs增殖抑制作用的的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.5μM;而親本細(xì)胞的是17.9μM。BrMC(0.1μM)能促進(jìn)LCSCs的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)向上皮細(xì)胞形態(tài)過渡。腫瘤球形成試驗和二次傳代成球試驗結(jié)果顯示BrMC(0.1、0.3、1μM)抑制LCSCs自我更新能力(P＜0.05)。Westernblot分析結(jié)果顯示BrMC(0.1、0.3、1μM)上調(diào)LCSCs的E-cadherin和ZO-1及下調(diào)N-cadherin和Vimenti

9、n。Matrigel體外細(xì)胞侵襲試驗結(jié)果顯示BrMC以濃度依賴方式抑制LCSCs體外細(xì)胞侵襲能力(P＜0.05)。Westernblot分析結(jié)果表明BrMC(0.1、0.3、1μM)下調(diào)LCSCs中CD133和CD44蛋白表達(dá)。原代裸鼠異種移植瘤實驗結(jié)果顯示，BrMC有效抑制LCSCs裸鼠皮下移植瘤的生長(P＜0.05)，并顯著降低來LCSCs移植瘤細(xì)胞CD44和CD133陽性表達(dá)率。再次接種裸鼠皮下移植瘤實驗結(jié)果顯示來自溶媒（精制橄欖

10、油灌胃）對照組小鼠的原代移植瘤細(xì)胞形成移植瘤并快速生長;BrMC(50mg/kg)處理小鼠的原代移植瘤細(xì)胞在受體小鼠中大部分不形成腫瘤。Westernblot分析結(jié)果顯示，BrMC下調(diào)LCSCs中β-catenin的表達(dá)。β-cateninsiRNA轉(zhuǎn)染有效降低β-catenin、CD133和CD44蛋白表達(dá)以及腫瘤球形成能力(P＜0.05），并增強BrMC(0.1μM)下調(diào)LCSCs中β-catenin蛋白表達(dá)和抑制腫瘤球形成能力作用

11、(P＜0.05）。Wnt3a條件培養(yǎng)基處理顯著提高LCSCs的β-catenin和干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44蛋白表達(dá)水平，并減弱BrMC(0.1μM)下調(diào)LCSCs中β-catenin蛋白表達(dá)和抑制腫瘤球形成能力作用（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.綜合應(yīng)用免疫磁球分選和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到的人肝癌MHCC97-H細(xì)胞系CD133+SFCs具有LCSCs特性。
　　2.新型白楊素類似物BrMC具有抑