鈉氫交換蛋白-1在肝癌細(xì)胞MHCC97-H侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、肝癌是世界范圍內(nèi)第五大最常見惡性腫瘤，也是我國最常見的惡性腫瘤之一，是我國的第二癌癥殺手。由于早期診斷和治療難度大，腫瘤惡性程度高，預(yù)后往往不理想，給大眾健康造成了極大的威脅。雖然以手術(shù)切除為主的綜合治療近年來取得了很大的進(jìn)步，但許多成功接受手術(shù)切除并且術(shù)后聯(lián)合多種輔助治療的患者，其預(yù)后仍然不佳。其原因是多方面的，但主要還是腫瘤的早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已屬晚期，治療難度大，且術(shù)后腫瘤容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。根據(jù)相關(guān)研究，多數(shù)肝癌患者主要死于

2、轉(zhuǎn)移相關(guān)的一些并發(fā)癥。因此，研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移各個(gè)環(huán)節(jié)中相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，并針對(duì)其中的環(huán)節(jié)制定相應(yīng)的治療措施具有十分重要的臨床意義。
　　鈉氫交換蛋白-1(Na+/H+exchanger 1，NHE1)是表達(dá)于細(xì)胞膜表面的離子交換蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH值，并且可以通過肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白錨定肌動(dòng)蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的功能。在許多腫瘤中都有NHE1的過表達(dá)或活性增強(qiáng)，并認(rèn)為其參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等

3、多個(gè)過程。但是，鈉氫交換蛋白-1在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮著怎樣的作用目前還不明確。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)合成的特異性NHE1-siRNA為實(shí)驗(yàn)手段，研究NHE1在肝癌細(xì)胞系MHCC97-H侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　首先設(shè)計(jì)合成3條針對(duì)NHE1基因的特異性小干擾RNA(small inter-fering RNA，siRNA)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MHCC97-H肝癌細(xì)胞系，通過realtime

4、PCR和Western blot的方法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞NHE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，并檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)外pH值變化。選擇一條抑制效率最高的NHE1-siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后用特異性NHE1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過免疫熒光染色、掃描電鏡、western blot、明膠酶譜、侵襲和遷移等實(shí)驗(yàn)方法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：
　　1、將針對(duì)NHE1基因的siRNA成功轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞MHCC97

5、-H后，realtimePCR、Western blot及細(xì)胞內(nèi)外pH值檢測結(jié)果顯示，序列為（正義鏈：5′-GCCCUGUUAAUCAUUCCGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGGAAUGAUUAACAGGGCTT-3′）的NHE1-siRNA抑制效率最高。將其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用特異性siRNA。
　　2、應(yīng)用特異性NHE1-siRNA抑制肝癌細(xì)胞NHE1后，熒光顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果顯示，NHE1-siRNA組MHCC97-H細(xì)胞發(fā)生

6、回縮，極性減弱，細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白網(wǎng)排列紊亂，形成減少，細(xì)胞表面?zhèn)巫慊乜s，形成減少或消失。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染特異性NHE1-siRNA后，細(xì)胞遷移能力減弱。
　　3、應(yīng)用特異性小干擾RNA抑制肝癌細(xì)胞NHE1后，侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，NHE1-siRNA組MHCC97-H細(xì)胞穿透小室基底膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。western blot和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NHE1-siRNA組細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)和活性均降低。推測NHE1可能通過