TiM-3在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular cancer，HCC)是人類(lèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的生理過(guò)程，EMT參與了許多生理和病理過(guò)程，并且發(fā)揮了重要作用，EMT的發(fā)生機(jī)制在眾多實(shí)體腫瘤中進(jìn)行了深入的研究，包括肝癌。然而肝癌治療需要對(duì)EMT發(fā)生的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入的研究。
　　T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3(Tim-3)是TIM基因家族的重要成員之一，被認(rèn)為參與了多種類(lèi)型癌的進(jìn)展，包括肝細(xì)胞癌

2、(HCC);在肝癌的進(jìn)展中，Tim-3被認(rèn)為是一種新的參與者，并且調(diào)節(jié)著肝癌的生物學(xué)行為。
　　本文旨在探討Tim-3在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制和Tim-3與肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。
　　第一部分 Tim-3在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型的建立
　　目的:
　　探討Tim-3在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用，檢測(cè)Tim-3在肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的表達(dá)情況，構(gòu)建Tim-3高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞模型，并檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窠⒊晒Α?/p>

3、
　　方法:
　　1、培養(yǎng)人類(lèi)肝癌細(xì)胞SMMC-7721、正常人肝細(xì)胞LO2。
　　2、熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time fluorescent polymerase chainreaction, Real-time PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)肝癌細(xì)胞SMMC-7721、正常人肝細(xì)胞LO2中Tim-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3、通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將PEX-3-hTim-

4、3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及Tim-3siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，轉(zhuǎn)染成功后建立了肝癌細(xì)胞Tim-3的高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞模型。
　　4、轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染成功的肝癌細(xì)胞表達(dá)GFP，鏡下可顯示綠色熒光。運(yùn)用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件，進(jìn)行圖像采集、分析。同時(shí)轉(zhuǎn)24小時(shí)后通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)Tim-3 mRNA表達(dá);72小時(shí)通過(guò)Western blot檢測(cè)Tim-3蛋白表達(dá)來(lái)

5、鑒定模型。
　　結(jié)果:
　　1、與正常人肝細(xì)胞LO2相比肝癌細(xì)胞MMC-7721高表達(dá)Tim-3，提示Tim-3可能與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　2、熒光顯微鏡觀察兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，兩組細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光，統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)染siRNA和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒PEX-3-hTim-3轉(zhuǎn)染效率分別為81.25％和83.36％。
　　3、RT-PCR和Western blot結(jié)果提示轉(zhuǎn)染PEX-3-hTim-3高表達(dá)質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞組，Tim

6、-3的表達(dá)明顯高于對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEX-3組。轉(zhuǎn)染Tim-3 siRNA，Tim-3的表達(dá)較對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA-NC組明顯減低。
　　結(jié)論:
　　Tim-3在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞均有表達(dá)，肝癌細(xì)胞MMC-7721 Tim-3的表達(dá)高于正常人肝細(xì)胞LO2，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;通過(guò)轉(zhuǎn)染成功建立肝癌細(xì)胞高表達(dá)Tim-3和低表達(dá)Tim-3細(xì)胞模型。
　　第二部分 Tim-3對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響及其機(jī)制

7、的研究
　　目的:應(yīng)用建立的高表達(dá)和低表達(dá)Tim-3肝癌細(xì)胞模型研究Tim-3對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響，探討Tim-3影響肝癌轉(zhuǎn)移侵襲性的可能機(jī)制。
　　方法:1、實(shí)驗(yàn)分三組:對(duì)照組:未接受轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞SMMC-7721;實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染Tim-3 siRNA，低表達(dá)Tim-3的肝癌細(xì)胞;陽(yáng)性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染PEX-3-hTim-3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞高表達(dá)Tim-3。2、三組肝癌細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡下觀察

8、三組細(xì)胞鏡下特點(diǎn)。3、通過(guò)MTT法檢測(cè)三組肝癌細(xì)胞增殖能力變化。
　　4.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕損傷愈合實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)三組肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。揭示Tim-3對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。5、RT-PCR檢測(cè)不同分組肝癌細(xì)胞Tim-3及EMT相關(guān)基因:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Slug、Snail、Smad，mRNA的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)Western blot檢測(cè)E-cadh

9、erin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Slug、Snail、Smad蛋白表達(dá)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。6、分析Tim-3表達(dá)與EMT相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性。7、統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)以平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
　　結(jié)果:1、SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡對(duì)三組的細(xì)胞形態(tài)觀察，與實(shí)驗(yàn)組相比較，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)多發(fā)為紡錘形態(tài)，細(xì)胞之間

10、形態(tài)和連接較少，表現(xiàn)為更強(qiáng)的遷移和侵襲性，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組上皮細(xì)胞多觸角凸起，表現(xiàn)為更強(qiáng)的緊密接觸和粘附性，表現(xiàn)出低的遷移和侵襲性。
　　2、MTT檢測(cè)三組肝癌細(xì)胞細(xì)胞增值率，在前12小時(shí)細(xì)胞增值率沒(méi)有顯著差異，12小時(shí)后三組細(xì)胞增值率出現(xiàn)顯著差異，在觀察的72小時(shí)內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，差異越來(lái)越明顯。培養(yǎng)72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，肝癌細(xì)胞增殖能力明顯下降，實(shí)驗(yàn)組增殖能力是對(duì)照組的71.71％(F=145.758，P＜0.05)陽(yáng)性對(duì)

11、照組細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，是對(duì)照組的260.12％，有顯著性差異(F=195.428，P＜0.05)。
　　3.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比較，肝癌細(xì)胞遷移和侵襲明顯減少，設(shè)置對(duì)照組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)為100;實(shí)驗(yàn)組遷移和侵襲的相對(duì)細(xì)胞數(shù)分別為:61±8和34±7;陽(yáng)性對(duì)照組遷移和侵襲的相對(duì)細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)分別為:157±10和179±11三組之間比較均有顯著性差異(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)說(shuō)

12、明抑制Tim-3表達(dá)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲力明顯下降。故Tim-3表達(dá)水平的改變，影響肝癌的遷移和侵襲性。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)72小時(shí)后三組細(xì)胞均向劃痕中間遷移，陽(yáng)性對(duì)照組肝癌細(xì)胞幾乎將中間劃痕鋪滿(mǎn)，對(duì)照組劃痕部位仍有一定間隙，實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞少量向劃痕中間遷移，實(shí)驗(yàn)組傷口愈合率較陽(yáng)性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=168.365，P＜0.05）。
　　4、RT-PCR結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組E-cadherin的表達(dá)較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(F=2830，P＜0.05)，而N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，差異均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組降低了Tim-3的表達(dá)，E-cadherin的表達(dá)較對(duì)照組明顯上升，與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(F=2932,P＜0.05)，同時(shí)N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、（P＜0.05），Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果同PCR結(jié)果一致，同樣表明抑制Tim-3表達(dá)，可阻止肝癌EMT的發(fā)生。
　　5、Tim-3的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)成負(fù)相關(guān)(r=-0.870，P=0.00＜0.05),Tim-3表達(dá)與N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad均呈現(xiàn)正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　結(jié)論:1、三組細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)

15、胞上皮細(xì)胞多觸角凸起，表現(xiàn)為更強(qiáng)的緊密接觸和粘附性呈現(xiàn)出低侵襲和轉(zhuǎn)移性。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞為紡錘形態(tài)，細(xì)胞之間形態(tài)和連接較少，表現(xiàn)為更強(qiáng)的遷移和侵襲性。陽(yáng)性對(duì)照中肝癌細(xì)胞獲得EMT的特點(diǎn)。
　　2、通過(guò)MTT法檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖率，陽(yáng)性對(duì)照組在細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)后，細(xì)胞增殖率高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，提示Tim-3表達(dá)可能影響肝癌細(xì)胞的增殖。
　　3、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)三組細(xì)胞的遷移及侵襲性，結(jié)果提示高表達(dá)

16、Tim-3的陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞表現(xiàn)較強(qiáng)的遷移及侵襲性，而實(shí)驗(yàn)組抑制Tim-3的表達(dá)，細(xì)胞的遷移及侵襲性明顯降低，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，提示Tim-3促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲。
　　4、Real-time PCR和Western bolt檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達(dá)。結(jié)果提示:陽(yáng)性對(duì)照組中上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)

17、下降，而間質(zhì)標(biāo)記物:N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達(dá)上升，從而提示肝癌細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;實(shí)驗(yàn)組抑制Tim-3的表達(dá)，E-cadherin的表達(dá)明顯上升，而間質(zhì)標(biāo)記物:N-cadherin、 MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達(dá)下降，肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制，提示Tim-3促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致遷移和侵襲能力增大，這與MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、