Tim-3和Th17細胞在免疫性肝損傷中作用及相關(guān)機制的研究.pdf

1、目的：用刀豆蛋白A（Con A）建立免疫性肝損傷模型，探討Tim-3和Th17細胞相關(guān)因子在發(fā)病過程中的動態(tài)變化及意義；靶向干預(yù)Tim-3通路后探討其對Th17細胞的影響。
　　方法：60只Wistar雄性大鼠隨機分為兩組，即模型組（50只）和對照組（10只）。模型組大鼠尾靜脈注射12.5mg/kg Con A，每周1次連續(xù)8周。對照組大鼠尾靜脈注射無菌PBS，每周1次連續(xù)8周。隨機從模型組中取10只大鼠，在第0周（0w）、第2周

2、（2w）、第4周（4w）、第6周（6w）、第8周（8w）時對大鼠實施體外心尖取血1.5 ml，分離血清后于-20℃?zhèn)溆谩?周后隨機從模型組中取出20只大鼠，酒精浸泡20分鐘后無菌取脾制備脾淋巴細胞。在脾淋巴細胞中加入Tim-3的單克隆抗體來阻斷Tim-3通路；用Tim-3的重組配體來激活Tim-3通路，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集細胞上清液于-20℃保存。生化分析法測血清中ALT、AST和ALB的表達；HE染色觀察肝臟組織

3、的病理變化；ELISA法測血清中Tim-3、IL-17A、IL-6、TGF-β和IL-23的表達及上清液中IL-17A和IL-6的表達；免疫組化法測肝臟組織中Tim-3、IL-17A和ROR-γt蛋白的表達；實時定量PCR測各組脾淋巴細胞ROR-γt mRNA的表達。
　　結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠的ALT及AST水平均顯著升高(P<0.05)，ALB水平顯著下降(P<0.05)。在模型組的不同階段中，HE染色檢測肝組織可見4

4、w時開始偶見假小葉，6w時量明顯增多，而8w時發(fā)現(xiàn)有明顯的炎性細胞和肝臟損傷，鏡下假小葉較多見；ELISA法檢測相應(yīng)的細胞因子可見IL-17A、IL-6、IL-23的動態(tài)趨勢是先升高，4w后開始降低(P<0.05)；Tim-3的動態(tài)趨勢則是先降低，4w以后開始升高(P<0.05)；免疫組化檢測相應(yīng)的蛋白可見4w時IL-17A和ROR-γt蛋白的水平明顯升高，而Tim-3蛋白的水平明顯降低。靶向干預(yù)后，與阻斷對照組相比，阻斷實驗組中IL-

5、17A和IL-6的水平升高(P<0.05)；與激活對照組相比，激活實驗組中IL-17A和IL-6的水平降低；實時定量PCR顯示與阻斷對照組相比，阻斷實驗組中ROR-γt mRNA的水平明顯增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：Tim-3及Th17細胞參與了免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展，其水平的變化可以在一定程度上反應(yīng)病情的嚴重程度，可望為免疫性肝損傷發(fā)生機制提供新的線索；免疫調(diào)控Tim-3通路可通過影響Th17細胞效應(yīng)，進而影響肝損傷的程度