基于Th17-Treg細(xì)胞平衡探討槲皮素治療免疫性肝損傷的作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　研究槲皮素(Quercetin)對(duì)雷公藤甲素（Triptolide，TP）引起肝損傷的保護(hù)性作用,同時(shí)初步探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、槲皮素對(duì)TP誘導(dǎo)急性肝損傷的保護(hù)性作用。50只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、TP模型組、槲皮素低劑量組（20mg/kg）、槲皮素中劑量組（50mg/kg）、槲皮素高劑量組（80mg/kg）。用藥組每日給予不同劑量的槲皮素，連續(xù)十天，每日一次；正常

2、對(duì)照組和模型組給予等量的5‰CMC-Na，末次給藥4h后，除正常組外其余各組均灌胃給予500μg/kg的 TP建立小鼠急性肝損傷模型，22h后取血，處死小鼠，取肝備用。分別檢測(cè)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，HE染色觀察小鼠肝組織病理改變，分光光度法檢測(cè)肝組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及還原型谷胱甘肽（GSH）的表達(dá)水平。
　　2、急性肝損傷及槲皮素應(yīng)用后 Th17/Treg細(xì)胞平衡

3、變化及TLR4-MyD88-NF-κB和 Tim-3信號(hào)通路對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡變化的影響。為研究肝損傷發(fā)生及槲皮素應(yīng)用后Th17/Treg細(xì)胞平衡變化情況，采用ELISA和RT-PCR法檢測(cè)小鼠體內(nèi)Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素IL-17、IL-10水平；免疫組化和 RT-PCR法檢測(cè)肝臟中維甲酸孤兒核受體（ROR-γt）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）表達(dá)，以此判斷Th17/Treg細(xì)胞比率；采用Western bl

4、ot分別檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB和Tim-3的表達(dá)水平。
　　3、TLR4通路阻斷劑TAK-242對(duì)Th17/Treg平衡變化的影響。雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、TP模型組、TAK-242(1mg/kg)組。除空白組外，模型組及TAK-242組均灌胃給予500μg/kg的TP建立小鼠急性肝損傷模型，在給予TP前1h，TAK-242組小鼠腹腔注射 TAK-242，對(duì)照組及模型組給予等

5、量生理鹽水。22h后取血，處死小鼠，無菌留取肝組織備用。分別檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST水平，HE染色觀察小鼠肝組織病理改變情況，分光光度法檢測(cè)肝組織勻漿中MDA、SOD及GSH的表達(dá)水平；采用ELISA和RT-PCR檢測(cè)小鼠體內(nèi)Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素IL-17、IL-10水平；免疫組化和 RT-PCR法檢測(cè)肝臟中維甲酸孤兒核受體（ROR-γt）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）表達(dá)，以此判斷 Th17/Treg細(xì)胞比率；

6、采用Western blot分別檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB和Tim-3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、與正常對(duì)照組相比，TP組小鼠血清中ALT、AST、MDA含量顯著升高，伴有SOD、GSH水平明顯降低，病理切片提示有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示肝損傷模型構(gòu)建成功。槲皮素低劑量組 ALT、AST、MDA水平略有降低，SOD、GSH水平稍有升高，但不明顯；槲皮素中劑量組ALT、AST、MDA含量降低，SOD、GSH水平升

7、高；槲皮素高劑量組ALT、AST、MDA水平降低更明顯，SOD、GSH水平顯著升高，病理切片顯示肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕，提示槲皮素高劑量組對(duì)TP誘導(dǎo)的肝損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　2、ELISA及RT-PCR結(jié)果均顯示，與模型組相比，槲皮素高劑量組能顯著降低IL-17表達(dá)水平，明顯升高IL-10表達(dá)水平；免疫組化結(jié)果顯示模型組Foxp3表達(dá)水平顯著降低，ROR-γt表達(dá)水平明顯升高，給藥后可以糾正這一失衡。Western Blo

8、t結(jié)果顯示模型組小鼠TLR4、MyD88、NF-κB水平顯著升高，Tim-3水平降低；給予高劑量槲皮素后可以降低TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)，Tim-3表達(dá)水平升高。
　　3、給予TAK-242后，血清中ALT、AST水平及肝臟組織中MDA、IL-17及TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)顯著降低，肝臟組織中SOD、GSH、IL-10及Tim-3的表達(dá)水平升高。肝臟病理切片顯示給予TAK-242后肝臟壞死程度明顯減輕。<