CD40siRNA對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎大鼠Th1-Th2與Th17-Treg平衡的影響.pdf

1、研究背景：
　　心肌炎是由感染或非感染因素導(dǎo)致的心肌炎癥性疾病，其中病毒感染為主要致病因素。目前研究表明，病毒性心肌炎患者的心肌組織損傷主要是由病毒直接損害和其引起的機(jī)體免疫反應(yīng)導(dǎo)致的。免疫反應(yīng)在心肌炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用，其中又以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)為主。豬心肌肌球蛋白誘導(dǎo)的自身免疫性心肌炎（EAM）是由CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的心臟炎癥性疾病模型。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，通常將CD4+T淋巴細(xì)胞分為Th1細(xì)

2、胞、Th2細(xì)胞、Th17以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等。T淋巴細(xì)胞亞群在細(xì)胞免疫及體液免疫中起著重要作用，并在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中占主要地位。國內(nèi)外有研究報(bào)道，Th1/Th2平衡與Th17/Treg平衡在HIV等傳染性疾病、自身免疫性甲狀腺疾病及自身免疫性肝炎等疾病的免疫反應(yīng)過程中起著重要作用，Th1、Th17表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng)作用，加重自身組織損傷，而Th2、Treg表現(xiàn)為抗炎作用。
　　T細(xì)胞的活化需要抗原識別提供第一信號以及共刺激

3、信號通路提供第二信號。CD40/CD40L共刺激信號通路是最具代表性的共刺激分子之一，在感染性疾病與自身免疫性疾病中起著十分重要的作用，阻斷該信號通路可以減輕疾病自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷。我們前期研究顯示應(yīng)用CD40Ig阻斷融合蛋白CD40/CD40L共刺激信號通路后對病毒性心肌炎具有明顯的治療作用。
　　小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是長度為21-25個核苷酸的小RNA分子，在RNA干擾

4、（RNAi）技術(shù)中占主導(dǎo)地位，可激發(fā)目標(biāo)mRNA的沉默，可以對免疫性疾病起到治療作用。本課題組前期已應(yīng)用CD40siRNA阻斷 CD40/CD40L共刺激信號通路對自身免疫性心肌炎進(jìn)行治療，證明其能減輕大鼠心肌炎癥，然而其具體分子作用機(jī)制尚未明確。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用CD40siRNA治療大鼠自身免疫性心肌炎，檢測大鼠心電圖、超聲心動圖及心肌組織病理變化，并檢測大鼠外周血Th1相關(guān)細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ、

5、Th2相關(guān)細(xì)胞因子白介素(IL)-4、Th7相關(guān)細(xì)胞因子IL-17及Treg相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β水平的變化，以探討CD40siRNA治療心肌炎的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　采用隨機(jī)數(shù)字表法將Lewis大鼠隨機(jī)分為正常對照組、EAM組、CD40siRNA治療組及siRNA對照組。第0天和第7天，EAM組、CD40siRNA治療組及siRNA對照組大鼠注射豬心肌肌球蛋白建立EAM模型。第7天，CD40siR

6、NA治療組大鼠予CD40siRNA治療。觀察各組大鼠基本情況，于第21天記錄各組大鼠心電圖及超聲心動圖后處死大鼠，觀察心肌組織病理變化并計(jì)算病理學(xué)積分，應(yīng)用ELISA方法檢測大鼠外周血IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β的水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.EAM組、CD40siRNA治療組及siRNA對照組中大鼠的總體發(fā)病率為100％，且各組大鼠均無死亡。各組大鼠體重自第0天起逐漸上升，EAM組自第6天起體重進(jìn)行性下降

7、，CD40siRNA治療組于第6天體重略下降后逐漸恢復(fù)。
　　2.正常組與CD40siRNA治療組大鼠心電圖均正常，EAM組與siRNA組心電圖各有1例出現(xiàn)室性早搏。
　　3.EAM組、CD40siRNA組及siRNA組大鼠超聲心動圖檢查顯示左心室內(nèi)徑擴(kuò)大或縮小、左室心肌肥厚、左室壁心肌動度減低及心包積液。EAM組和siRNA組左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)與左室短軸縮短率(LVFS)較正常對照組均明顯減低(p＜0.05)，CD4

8、0siRNA治療組LVEF與LVFS均顯著高于EAM組(p＜0.05)。
　　4.EAM組、CD40siRNA治療組及siRNA對照組大鼠心肌組織病理檢查顯示心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤。CD40siRNA治療組心肌組織病理學(xué)積分明顯低于EAM組(p＜0.05)。
　　5.EAM組大鼠外周血IFN-γ及IL-4水平較正常對照組均明顯升高(p＜0.05)。CD40siRNA治療組大鼠外周血IFN-γ水平較EAM組下

9、降，而IL-4水平較EAM組明顯升高(p＜0.05)。
　　6.EAM組大鼠外周血IL-17及TGF-β水平較正常對照組均升高(p＜0.05)。CD40siRNA治療組大鼠外周血IL-17水平較EAM組降低，而TGF-β水平較EAM組明顯升高(p＜0.05)。
　　7.大鼠外周血IFN-γ水平與心肌組織病理積分呈正相關(guān)(r=0.755，p＜0.05)，IL-4水平與心肌組織病理積分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.636，p＜0.05)。

10、
　　8.大鼠外周血IL-17水平與心肌組織病理積分呈正相關(guān)(r=0.841，p＜0.05)，TGF-β水平與心肌組織病理積分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.563，p＜0.05)。
　　9.大鼠外周血IFN-γ水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.570，p＜0.05)，IL-4水平與LVEF呈正相關(guān)(r=0.521，p＜0.05)。
　　10.大鼠外周血IL-17水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635，p＜0.05)，TGF-β

11、水平與LVEF呈正相關(guān)（r=0.541，p＜0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1.CD40siRNA可明顯減輕EAM大鼠心肌炎癥，改善心功能。
　　2.EAM組大鼠心肌炎急性期出現(xiàn)Th1/Th2和Th17/Treg失衡，以Th1和Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)為主，存在Th1/Th2和Th17/Treg偏移。
　　3.CD40siRNA可抑制Th1和Th17介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，并增強(qiáng)Th2與Treg介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)，可糾正Th