雷帕霉素調(diào)節(jié)Th17-Treg平衡在肝纖維化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分雷帕霉素改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化
　　目的：觀察雷帕霉素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響
　　方法：6~8周齡雄性C57BL/6小鼠30只隨機(jī)分成正常組、模型組、治療組，每組10只。采用腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立小鼠肝纖維化模型；其中，模型組和治療組給予腹腔注射 CCl4，雷帕霉素溶于PBS，治療組以1.25mg/kg腹腔注射，1次/d，模型組每天給予等量的PBS。治療8周后，血清行血生化檢查，肝組織行病理

2、HE染色和Masson染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化和纖維化維程度；分別采用免疫組化檢測(cè)肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor Beta1，TGF-β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：雷帕霉素治療組肝功能較模型組明顯好轉(zhuǎn)；病理組織學(xué)顯示雷帕霉素能明顯改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)和肝纖維化；免疫組化染色檢測(cè)顯示，與模

3、型組比較，雷帕霉素治療組肝臟組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)均降低。結(jié)論：雷帕霉素可明顯改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)，減輕肝纖維化。
　　第二部分雷帕霉素抑制Th17細(xì)胞反應(yīng)
　　目的：觀察雷帕霉素對(duì)肝纖維化形成過(guò)程中Th17細(xì)胞表達(dá)的影響。
　　方法：通過(guò)腹腔注射CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，并使用雷帕霉素治療，方法及藥量同上，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞含量的變化，以及Western Blot檢測(cè)肝內(nèi)

4、核孤兒受體（orphan nuclear hormone receptor，ROR）γt表達(dá)情況。
　　結(jié)果：經(jīng)雷帕霉素治療后，肝脾Th17細(xì)胞比例明顯比PBS治療組降低，且肝內(nèi)ROR-γt表達(dá)水平與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果相同。
　　結(jié)論：雷帕霉素可能抑制介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞含量，從而抑制肝纖維化進(jìn)展。
　　第三部分雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖
　　目的：探索雷帕霉素對(duì)肝纖維化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能的影響

5、r>　　方法：通過(guò)腹腔注射CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，給予雷帕霉素治療，方法及藥量同上，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝脾Treg細(xì)胞含量的變化，以及Western Blot檢測(cè)肝內(nèi)Foxp3（Forkhead box p3）表達(dá)水平。體外分離雷帕霉素治療組或PBS治療組來(lái)源的Treg細(xì)胞，與CD4+CD25-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共培養(yǎng)，3HTdR摻入法檢測(cè)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能；體外分離提取正常小鼠肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell

6、，HSC）分別與雷帕霉素治療組或PBS治療組來(lái)源的Treg細(xì)胞共培養(yǎng)，免疫熒光和Western blot檢測(cè)HSCs激活情況。
　　結(jié)果：雷帕霉素治療組肝脾Treg細(xì)胞比例明顯比PBS治療組升高，且肝內(nèi)Foxp3表達(dá)水平與也相應(yīng)增加。同PBS治療組來(lái)源的Treg細(xì)胞比較，雷帕霉素治療組來(lái)源的Treg細(xì)胞抑制CD4+CD25-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，以及更易抑制HSCs的激活。
　　結(jié)論：雷帕霉素不僅可促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖，