甘草甜素在肝纖維化中作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的：肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)過(guò)程，它產(chǎn)生的病理學(xué)基礎(chǔ)是肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的生成和降解失衡，致使細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生及在肝臟的異常沉積。研究證實(shí)肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，肝臟受到損傷因素的刺激后激活肝星狀細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生。肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，該細(xì)胞的活化是肝纖維化最終的共同通

2、路。這是我們選擇肝星狀細(xì)胞作為研究肝纖維化靶細(xì)胞的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)所選藥物甘草甜素(Glycyrrhizin)是甘草根莖的提取物，它是甘草次酸和葡萄糖醛酸的共軛化合物，具有抗損傷和抗病毒等多種作用，在臨床用于肝臟方面的治療已有二十余年。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素在肝纖維化的防治中也同樣具有顯著療效。甘草甜素雖然通過(guò)不同的的機(jī)制及途徑在肝纖維化中發(fā)揮效用，但它抗肝纖維化的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制仍然未很好的闡明。 為進(jìn)一步探討甘草甜素在肝

3、纖維化中作用的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)法(MTTassay)探討甘草甜素對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響；利用抑制性消減雜交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建甘草甜素處理后的肝星狀細(xì)胞靶基因的cDNA消減文庫(kù)及篩選肝星狀細(xì)胞的靶基因，旨在從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)角度探討甘草甜素在肝纖維化中的作用機(jī)制，為甘草甜素在肝纖維化的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。 方法：1.甘草甜

4、素處理肝星狀細(xì)胞，通過(guò)顯微鏡觀察甘草甜素對(duì)體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響，并繪出生長(zhǎng)曲線；同時(shí)用四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MTT法)了解甘草甜素對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖影響的量效關(guān)系。 2.以甘草甜素處理的肝星狀細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，未用甘草甜素作用的相同細(xì)胞系作為對(duì)照組；24h后制備細(xì)胞裂解液，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切后，將實(shí)驗(yàn)組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與對(duì)照組cDNA進(jìn)行兩次消減雜交及兩次抑

5、制性多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，將產(chǎn)物與T/A載體連接，構(gòu)建cDNA消減文庫(kù)，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，隨機(jī)挑選克隆PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序及同源性分析。 3.以未用甘草甜素處理的相同細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組，甘草甜素處理的肝星狀細(xì)胞作為對(duì)照組；24h后制備細(xì)胞裂解液，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切后，將實(shí)驗(yàn)組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與對(duì)照組cDNA進(jìn)行兩次消減雜交及兩次抑制性多聚酶鏈反應(yīng)(PCR

6、)，將產(chǎn)物與T/A載體連接，構(gòu)建cDNA消減文庫(kù)，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，隨機(jī)挑選克隆PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序及同源性分析。 結(jié)果：1.甘草甜素濃度在0.6mmol/L以上時(shí)，在體外能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，且隨其濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果越顯著；甘草甜素亦可引起肝星狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 2.成功構(gòu)建甘草甜素處理的肝星狀細(xì)胞上調(diào)基因的差異表達(dá)cDNA消減文庫(kù)。文庫(kù)擴(kuò)增后得到36個(gè)陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR分析

7、，均得到200-1000bp插入片段。隨機(jī)選擇20個(gè)克隆，對(duì)插入片段隆進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出12個(gè)已知上調(diào)基因序列。 3.成功構(gòu)建甘草甜素處理的肝星狀細(xì)胞下調(diào)基因的差異表達(dá)cDNA消減文庫(kù)。文庫(kù)擴(kuò)增后得到15個(gè)陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR分析，均得到200-1000bp插入片段。隨機(jī)選擇10個(gè)克隆，對(duì)插入片段隆進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出4個(gè)已知下調(diào)基因序列。 結(jié)論：1.甘草甜素對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖具有抑

8、制作用，而且具有劑量、時(shí)間效應(yīng)。抑制肝星狀細(xì)胞的增殖可能是甘草甜素的抗肝纖維化作用機(jī)制之一。 2.證實(shí)甘草甜素可上調(diào)肝星狀細(xì)胞已知基因的表達(dá)，其中篩選到的上調(diào)基因鐵蛋白重鏈(ferritin，heavypolypeptide)、透明質(zhì)酸介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)受體(receptorforhyaluronan-mediatedmotility，RHAMM)、β-胡蘿卜素-15，15'-雙加氧酶(beta-carotene15，15'-dio

9、xygenase)可通過(guò)不同的機(jī)制抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，鐵蛋白重鏈還具有抗氧化應(yīng)激作用而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。推測(cè)甘草甜素可促使以上基因表達(dá)增強(qiáng)而抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，減輕氧化損傷從而使肝纖維化好轉(zhuǎn)或逆轉(zhuǎn)。 3.甘草甜素同時(shí)可下調(diào)肝星狀細(xì)胞的相關(guān)基因，其中DNA損傷結(jié)合蛋白1(damage-specificDNAbindingprotein1，Ddb1)、Toll/interleukin-1樣受體3(Toll/interleuk