熱休克蛋白47在日本血吸蟲肝纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　肝纖維化(hepatic fibrosis)是機體對慢性肝損傷的一種修復反應,是病毒性肝炎、血吸蟲肝病及酒精性肝炎等慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段,也是多種慢性肝臟疾病最終導致肝功能衰竭的主要病理改變和共同通路。延緩和防止肝纖維化是防治慢性肝臟病進展的關(guān)鍵。全球大約2億人口受血吸蟲病威脅,目前我國仍有12省有新發(fā)日本血吸蟲病病例報道,日本血吸蟲所致肝硬化仍嚴重影響人們的生活及健康。肝纖維化是細胞外基質(zhì)(Extra

2、cellular matrix, ECM)增生和降解不平衡,導致可逆性積累的結(jié)果。大量研究支持肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　生理條件下 HSCs處于靜息狀態(tài),當肝臟受到各種病因(如血吸蟲蟲卵誘發(fā)的IV型超敏反應)刺激時,HSC的表型和功能會發(fā)生變化,如脂滴、維生素 A丟失、某些蛋白表達增加如a-平滑肌蛋白(α-Smooth muscle act

3、in,α-SMA)、突觸素(synaptophysin, syn)、熱休克蛋白47(heat shock protein,HSP47),并釋放一些細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)等,通過細胞因子的級聯(lián)放大作用促進自身進一步活化。自身進一步活化后,HSCs所發(fā)揮的功能效應主要表現(xiàn)為

4、合成和分泌含有大量膠原纖維(Ⅰ和Ⅲ型膠原)的ECM。調(diào)節(jié) ECM降解的酶類主要有基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)與組織金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs),TIMPs是抑制MMPs活性的一組多功能因子家族, MMPs與 TIMPs以1∶1的比例形成 MMP-TIMP復合體,阻斷 MMPs與膠原底物結(jié)合,從而抑制MMPs的活

5、性,降低膠原的降解。在肝纖維化生成和進展中纖溶系統(tǒng)有雙重作用:其一,降解竇周間隙細胞外基質(zhì),破壞細胞之間的正常聯(lián)系而促進 HSCs的增殖和遷移;其二,通過 TGF-β1的活化,上調(diào) PAI-1和TIMPs的合成,從而促進細胞外基質(zhì)的合成和沉積,并且抑制纖溶酶的生成和基質(zhì)降解。
　　HSP47(heat shock protein47,HSP47)是機體受到應激后合成增加的應激蛋白,主要存在于膠原合成細胞(如肝星狀細胞)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,

6、已發(fā)現(xiàn)在多種疾病纖維化病理過程中HSP47上調(diào)與膠原的合成和纖維化進展在時間和分布上呈正相關(guān),抑制HSP47的表達,可以抑制膠原合成及抑制組織纖維化,而與肝纖維化關(guān)系的研究目前尚處于探索階段。熱休克蛋白47在血吸蟲病肝纖維化過程中扮演的角色和作用尚未見報道,尤其對活化 HSC功能效應的影響研究甚少。
　　基因水平干預―有害‖基因高表達可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用,也為探索肝纖維化臨床治療方法提供了新的思路。研究發(fā)

7、現(xiàn),尾靜脈高壓注射可以使質(zhì)粒-DNA在小鼠肝臟獲得高效表達。尾靜脈高壓注射,可延長質(zhì)粒-DNA在肝竇中的停留時間,此外,多數(shù)藥物的首關(guān)代謝在肝臟進行,質(zhì)粒-DNA被肝組織細胞攝取。利用該方法針對HSP47基因進行干預后對血吸蟲肝纖維化病程的影響,進一步闡明其作用機制有重要意義。
　　第一部分 HSP47在日本血吸蟲病肝纖維化組織中的表達
　　目的：
　　觀察 HSP47在臨床日本血吸蟲病肝臟組織中的表達情況及血吸蟲病肝

8、纖維化小鼠動物模型中的動態(tài)變化,旨在探討 HSP47在肝纖維化進程中的作用。
　　方法：
　　1.收集2008年～2011年間同濟醫(yī)院門診和住院部的部分血吸蟲病肝纖維化患者肝穿標本及臨床資料48例。免疫組織化學及Real-time PCR檢測 HSP47、TGF-β1、CTGF及I型膠原的表達,HE染色和Masson染色觀察病理改變和膠原纖維沉積狀況。
　　2.將血吸蟲尾蚴(20±1)經(jīng)腹部皮膚感染 Balb/c小鼠,

9、建立實驗性血吸蟲病肝纖維化小鼠模型,同時設(shè)正常對照組。分別在感染后第6周及12周取小鼠肝臟, HE及Masson染色觀察病理改變,免疫組織化學和Real-time PCR檢測 HSP47、TGF-β1和I型膠原的表達。
　　結(jié)果：
　　1.與正常對照組比較,S2期肝纖維化小鼠匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)有大量纖維組織增生和纖維沉積,至 S4期時,肝小葉結(jié)構(gòu)已被破壞,同時中心靜脈區(qū)和匯管區(qū)出現(xiàn)纖維間隔。Masson染色結(jié)果顯示:與對照組比

10、較,肝纖維化組組織中膠原在肝間質(zhì)區(qū)顯著增多,且肝組織內(nèi)膠原含量隨纖維化分級同步增高。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示:與對照組比較,肝纖維化組織中HSP47及肝星狀細胞活化標志(α-SMA)表達亦顯著增加,且在匯管區(qū)、間質(zhì)區(qū)發(fā)生纖維化區(qū)域明顯;TGF-β1表達顯著增加,其主要集中在炎癥浸潤、纖維化形成區(qū)。
　　3.選取 S0-S4期患者肝活檢組織,Real time PCR檢測 HSP47-mRNA表達,隨肝纖維化進展逐漸增加,且

11、于 S3期達高峰,于 S4期略下降,但二者與 S0期 HSP47的表達相比較,仍有統(tǒng)計學差異。同時,分析肝活檢組織病理炎癥分級與 HSP47表達的關(guān)系,無明顯相關(guān)性。
　　4.TGF-β1、CTGF、Collagen I在血吸蟲病肝纖維化患者不同纖維化分期中的表達:實驗結(jié)果示 TGF-β1在肝纖維化 S1期即有表達,且 S2期與 S1期相比,差異具有顯著性;CTGF在肝纖維化 S2-S4期中分別與 S0期相比,均顯著增加;肝組織內(nèi)

12、 I型膠原含量與肝纖維化分級一致,S1-S4期與 S0期相比,其表達均有統(tǒng)計學差異。
　　5.日本血吸蟲小鼠ALT和AST水平于感染第6周達到高峰,與感染前相比,均顯著增高,達峰值后開始回落,至感染第12周基本接近感染前的水平。小鼠肝組織形態(tài)學改變:感染第6W,肝組織 HE及Masson染色均可見蟲卵沉積,至感染第12W,肝組織 HE染色可見纖維組織沿蟲卵肉芽腫呈干線性生長,Masson染色示大量藍色膠原纖維沉積。
　　6.

13、日本血吸蟲小鼠肝組織 HSP47-mRNA于感染第6W、8W、12W表達較感染前均顯著升高(p<0.01),并在感染第8周達峰值,后有所回落,但仍高于正常表達。Western-blot檢測 HSP47隨感染后纖維化進展,其表達逐漸增加(p<0.01)。
　　結(jié)論：
　　HSP47及TGF-β1、CTGF在臨床肝纖維化和血吸蟲動物模型組織中表達上調(diào),且 HSP47與膠原表達部位一致, HSP47促纖維化作用與其增加膠原蛋白合成

14、有密切關(guān)系,且 TGF-β1、CTGF網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)參與血吸蟲肝纖維化的進程
　　第二部分 HSP47-shRNA的構(gòu)建及其細胞水平對 HSP47表達的影響
　　目的：
　　針對肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵基因構(gòu)建 HSP47-ShRNA,初步驗證其能否在體外 NIH/3T3細胞系干預 HSP47基因的表達,并觀察其對該細胞功能學的影響。
　　方法：
　　1.設(shè)計 HSP47-shRNA模板,并將其分別設(shè)計于 U6啟動子的下

15、游引物,將 U6啟動子及其下游 HSP47-shRNA的模板雙鏈 DNA裝入載體,構(gòu)建 pGCsi-U6/Neo/HSP47-shRNA。
　　2.細胞水平轉(zhuǎn)染 HSP47-shRNA與非相關(guān)干擾質(zhì)粒作為對照,分別于24h、48h收集細胞,采用Real-time PCR、Western-blot技術(shù)檢測 HSP47 mRNA及蛋白水平表達;Real-time PCR和ELISA法檢測 TGF-β1。同時觀察對該細胞分泌膠原功能的影

16、響。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建 HSP47-shRNA載體,通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染入 NIH/3T3細胞,轉(zhuǎn)染效率約60％。轉(zhuǎn)染12h,可見少量綠色熒光細胞,隨轉(zhuǎn)染時間的延長,細胞熒光表達量逐漸增加,各干擾質(zhì)粒于轉(zhuǎn)染72h熒光表達最強。
　　2.ShRNA干擾顯著抑制HSP47的表達,且 ShRNA-HSP47-1于轉(zhuǎn)染24h對 HSP47的沉默效率最佳,為(25.83±1.794)％。TGF-β1,隨 HSP47表達

17、下調(diào),有一定程度抑制,與未干預空白組及非相關(guān)對照組比較均有統(tǒng)計學差異。
　　3.HSP47經(jīng)干預后,NIH/3T3細胞膠原合成和分泌明顯減少,且以 ShRNA-HSP47-1轉(zhuǎn)染24h抑制最明顯,與空白組比較有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了HSP47-shRNA干擾質(zhì)粒,并初步證實其對 HSP47的表達干預有效,為進一步的體內(nèi)干預實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分 HSP47-shRNA對血吸蟲尾蚴誘導的鼠

18、肝纖維病程的干預作用
　　目的：
　　觀察 HSP47-shRNA血吸蟲肝纖維化小鼠體內(nèi) HSP47的表達及對引起肝纖維化的細胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,最終明確 HSP47對血吸蟲小鼠肝纖維化病情發(fā)展的影響。
　　方法：
　　1.建立日本血吸蟲感染小鼠的動物模型,于感染第6W經(jīng)尾靜脈高壓注射,1次/周,體內(nèi)轉(zhuǎn)染 HSP47-shRNA,干預至感染第14W,檢測目的基因在肝臟的體內(nèi)表達效率;
　　2.將 HSP47-

19、shRNA通過尾靜脈高壓注射后,觀察小鼠生存率,并于感染第6W、8W、14W動態(tài)記錄脾臟指數(shù)、肝組織大體、血清生化學改變、肝組病理學改變。
　　3.取感染第6W、8W、14W肝組織石蠟切片行天狼星紅-苦味酸染色,偏振光顯微鏡下閱片,利用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件對肝組織總膠原及I、III型膠原定量。
　　4.通過 Real-Time PCR、免疫組化、ELISA、Western-blot等技術(shù)檢測各干預組

20、間HSP47表達下調(diào)情況,以及其干預后對膠原合成、細胞因子(TGF-β1、CTGF、IL-13、IL-17、MMP-9、TIMP-1及PAI-1)表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度 HSP47-shRNA對血吸蟲病肝纖維化小鼠模型干預至感染第14W,高、中、低劑量組生存率分別為33.33％、25％、25％,非相關(guān)對照組為16.67％。
　　2.HE染色示肝纖維化較對照組明顯減輕;Masson染色提示:肝內(nèi)膠原沉

21、積較對照組明顯減少。
　　3.干預 HSP47表達后,與 PBS組及非相關(guān)對照組相比,IL-13、IL-17、TGF-β、CTGF、TIMP-1下降顯著,MMP-9、PAI-1升高明顯,差別均具有顯著性(p<0.05);星狀細胞活化的標志(a-SMA)表達明顯降低;肝內(nèi)膠原蛋白(collagenI/III)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　干預 HSP47表達,可以明顯改善肝纖維化,HSP47除了可以影響膠原蛋白的表達,還涉