熱休克蛋白47在腎臟纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 腎纖維化是指在各種致病因子如炎癥、損傷等作用下，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)增多，尤其是基質(zhì)蛋白合成增加，基質(zhì)降解受抑制造成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的大量堆積導(dǎo)致的腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化。它是多種慢性腎臟疾病最終導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病理改變和共同通路，延緩和防止腎纖維化是防治慢性腎臟病進(jìn)展的關(guān)鍵。膠原是ECM的主要成分，在各種腎臟纖維化疾病中合成都顯著增高，它合成和沉積增加與腎臟纖維

2、化的啟動(dòng)和進(jìn)展有密切關(guān)系。
　　 熱休克蛋白47(Heat shock protein47，HSP47)是一種膠原特異性的“分子伴侶”，在膠原生物合成過(guò)程中協(xié)助前膠原修飾、折疊、裝配，是膠原成熟的必要條件，其表達(dá)影響膠原產(chǎn)量。HSP47在多種腎臟纖維化的動(dòng)物和臨床疾病研究中包括高血壓腎硬化模型大鼠，5/6腎臟切除大鼠模型，人類IgA腎病及糖尿病腎病腎組織等，表達(dá)都明顯增高，且與膠原同步增加。并初步證實(shí)動(dòng)物體內(nèi)抑制其表達(dá)可減輕纖維

3、化的程度，如HSP47反義寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染抗Thy-1腎小球腎炎大鼠，HSP47 siRNA轉(zhuǎn)染UUO大鼠，都可以改善腎纖維化，提示HSP47在腎臟纖維化中的作用可能并不局限于調(diào)節(jié)膠原的合成。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，能將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，通過(guò)保守的三級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(MAPKKK—MAPKK-MAPK)激

4、活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulated kinase， ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminal kinase，JNK)是它的兩個(gè)主要家族成員。其中ERK1/2又被稱為絲裂原活化的MAPK通路，主要功能是介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化；JNK主要功能是調(diào)節(jié)參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)證明ERK1/2，JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路可介導(dǎo)外界刺激所致的熱休克蛋白

5、合成。
　　 基于以上分析得知HSP47是膠原合成的特異性“分子伴侶”，其在腎臟纖維化中表達(dá)增高，且有促腎臟纖維化作用，但其作用機(jī)制可能不局限于對(duì)膠原合成的調(diào)控，MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與調(diào)控HSP47的表達(dá)。為此，本實(shí)驗(yàn)開展如下的研究。
　　 目的：
　　 利用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型，初步觀察HSP47在腎臟組織的表達(dá)情況，旨在探討HS

6、P47在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用。
　　 方法：
　　 SD大鼠隨機(jī)分為模型組(UUO組)和假手術(shù)組(Sham組)，每組8只。采用單側(cè)(左)輸尿管結(jié)扎方法，建立梗阻性腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型，Sham組只游離輸尿管而不結(jié)扎。術(shù)后14天處死動(dòng)物，取結(jié)扎側(cè)腎臟，同時(shí)處死假手術(shù)組大鼠，取出腎組織。觀察各組之間蛋白尿，血肌酐水平，運(yùn)用HE，Masson染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變，采用免疫組化方法檢測(cè)HSP47、膠原Ⅳ(Colla

7、genⅣ)與纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)的部位和變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.與假手術(shù)組比較，UUO模型組大鼠血肌酐水平升高，蛋白尿無(wú)顯著差異。
　　 2.與假手術(shù)組比較，光鏡下UUO模型組大鼠腎組織出現(xiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)面積增寬、部分腎小管萎縮、腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性。
　　 3.Masson染色結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，UUO模型組大鼠腎組織膠原在腎小

8、管周圍、間質(zhì)區(qū)顯著增多。
　　 4.免疫組化結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，UUO模型組大鼠腎組織HSP47表達(dá)顯著增加，在腎小管周圍、間質(zhì)區(qū)表達(dá)增加最明顯；CollagenⅣ表達(dá)顯著增加，在腎小管基底膜、間質(zhì)區(qū)表達(dá)增加最明顯；FN表達(dá)顯著增加，主要表達(dá)在腎間質(zhì)區(qū)。
　　 結(jié)論： HSP47在UUO大鼠模型腎臟組織表達(dá)上調(diào)，且與膠原表達(dá)部位一致，提示HSP47促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，且該作用與其促進(jìn)膠原蛋白的合成有關(guān)。
　　

9、 目的：
　　 研究HSP47在TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞合成Collagen及FN等ECM蛋白過(guò)程中的作用，并檢測(cè)其對(duì)PAI-1表達(dá)的影響，探討HSP47在ECM合成與降解平衡中的角色。
　　 方法：
　　 常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分為對(duì)照組、TGF—β1組、HSP47siRNA組，對(duì)照組為無(wú)血清DMEM組，TGF-β1組為TGF-β1誘導(dǎo)，HSP47siRNA組為HSP47siRNA與TGF-β1共同作用，R

10、T-PCR檢測(cè)HSP47、collagenⅣ、FN、PAI-1的mRNA表達(dá)，Western Blot檢測(cè)HSP47、collagenⅣ、FN蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)PAI-1的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)的HK-2可表達(dá)HSP47，不同濃度TGF-β1(0、2.5、5、10ng/ml)干預(yù)不同時(shí)間(12h、24h、48h)，HSP47基因和蛋白表達(dá)都呈逐漸增高的趨勢(shì)，10ng/ml TGF—β1干預(yù)HK

11、-2細(xì)胞48h時(shí)HSP47在基因和蛋白水平上都表達(dá)最強(qiáng)。
　　 2.不同濃度TGF—β1(0、5、10ng/ml)干預(yù)HK-2不同時(shí)間(12h、24h、48h)，collagenⅣ、FN、PAI-1在基因，蛋白水平表達(dá)呈逐漸增高的趨勢(shì)，TGF-β1(10ng/ml)作用48小時(shí)三者基因和蛋白水平表達(dá)最強(qiáng)。
　　 3.HSP47siRNA組(HSP47siRNA處理24h，再TGF—β110ng/ml干預(yù)48)與TGF-β

12、110ng/ml干預(yù)48h比較，前者HSP47，collagenⅣ，F(xiàn)N，PAI-1mRNA和蛋白的表達(dá)都明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TGF-β1呈濃度和時(shí)間依賴模式上調(diào)HK-2細(xì)胞HSP47的表達(dá)。
　　 2.TGF—β1呈濃度和時(shí)間依賴模式上調(diào)HK-2細(xì)胞collagenⅣ，F(xiàn)N，PAI-1表達(dá)。3.HSP47siRNA可以下調(diào)TGF—β1誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞分泌的collagenⅣ、FN、PAI-1的

13、mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 目的：
　　 研究絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑是否介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞上調(diào)HSP47表達(dá)。
　　 方法：
　　 應(yīng)用ERK、JNK特異性抑制劑觀察對(duì)TGF—β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞上調(diào)HSP47表達(dá)的影響
　　 結(jié)果：
　　 應(yīng)用PD98059、SP600125分別特異性抑制MAPK途徑的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、c—Jun-氨基末端

14、激酶(JNK)通路，對(duì)TGF-β1上調(diào)HSP47的作用有不同影響。
　　 1.PD98059可以抑制TGF-β1對(duì)HK-2細(xì)胞ERK信號(hào)通路的活化和HSP47的表達(dá)，且不同濃度PD98059(25uM、50uM、7SUM)對(duì)HSP47的抑制效果有差異。
　　 2.SP600125可以抑制TGF—β1對(duì)HK-2細(xì)胞JNK信號(hào)通路的活化和HSP47的表達(dá)，且不同濃度SP600125(10uM、20uM、30uM)對(duì)HSP47