ICOSL-ICOS信號介導(dǎo)日本血吸蟲感染小鼠肝纖維化及HSCs活化的分子機(jī)制.pdf

1、血吸蟲病的發(fā)病機(jī)制主要是蟲卵引起的肝臟和腸等組織臟器產(chǎn)生肉芽腫病變，并形成繼發(fā)性的肝纖維化。盡管目前對于血吸蟲病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但是一些研究提示了可能參與血吸蟲病的效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子。已有大量研究證實(shí)，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSCs）是血吸蟲病肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。在血吸蟲病炎癥過程所分泌的多種細(xì)胞因子中，TGF-β1(transforming growth factor-β1)是目前公認(rèn)的

2、最關(guān)鍵的促纖維化細(xì)胞因子之一。Smad蛋白是唯一的TGF-β1受體后信使分子，介導(dǎo)TGF-β1信號從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）沉積在肝臟形成肝纖維化。最近研究報(bào)道，microRNAs通過靶向作用于一個(gè)或多個(gè)TGF-β1/Smad信號通路的mRNA,促進(jìn)或抑制HSCs的活化，從而影響肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。
　　課題組前期研究表明，日本血吸蟲感染IC

3、OS-Tg（ICOS transgenic,ICOS-Tg）小鼠后可顯著上調(diào)ICOSL/ICOS信號發(fā)揮免疫效應(yīng)。共刺激信號ICOSL/ICOS不僅介導(dǎo)Th2細(xì)胞極化，使免疫反應(yīng)向Th2偏移，而且該信號也介導(dǎo)Th17的極化。ICOS信號的上調(diào)最終促進(jìn)肝蟲卵肉芽腫的形成及繼發(fā)性肝纖維化。本研究應(yīng)用ICOS-Tg小鼠及其野生型 FVB/NJ小鼠作為日本血吸蟲病實(shí)驗(yàn)動物模型，探討共刺激信號ICOSL/ICOS對日本血吸蟲感染小鼠HSCs活化及

4、肝纖維化形成TGF-β1/Smad信號通路的影響，以期找到一個(gè)調(diào)控HSCs活化及肝纖維化的新靶點(diǎn)，為治療肝纖維化提供一個(gè)新的免疫療法。本研究共三個(gè)部分：
　　一、日本血吸蟲感染小鼠肝星狀細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)
　　目的：日本血吸蟲感染小鼠原代HSCs的分離、鑒定和培養(yǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：采用在體原位肝臟酶灌注法和密度梯度離心技術(shù)，分離感染前（0W）、感染早期（4W）和感染急性病變期（7W、9W）ICOS-

5、Tg小鼠及 FVB/NJ小鼠原代HSCs。根據(jù)臺盼藍(lán)拒染法鑒定原代HSCs的成活率，根據(jù)其在328nm波長紫外激發(fā)光下自發(fā)藍(lán)綠色熒光特性以及其特異性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）鑒定原代HSCs的純度。
　　結(jié)果：新鮮分離的小鼠原代 HSCs的得率為（2.34±0.05）×106個(gè)/鼠，存活率在91％以上，其純度達(dá)到90%。倒置熒光顯微鏡于波長328nm的紫外激發(fā)光下觀察原代HSCs，新鮮分離的HSCs能夠自發(fā)藍(lán)綠色熒光。

6、分離的原代HSCs經(jīng)GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，細(xì)胞漿中出現(xiàn)紅色熒光。原代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　結(jié)論：日本血吸蟲感染小鼠后，分離培養(yǎng)的原代 HSCs存活率及純度達(dá)90%以上滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　二、共刺激信號ICOSL/ICOS對 HSCs中促纖維化分子基因表達(dá)水平的影響
　　目的：探討共刺激信號ICOSL/ICOS的上調(diào)，對感染日本血吸蟲ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs活化程度以及肝纖維化進(jìn)

7、程的影響。
　　方法：應(yīng)用Trizol Reagent抽提培養(yǎng)7d原代HSCs的總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR）法檢測ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCsα-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因的表達(dá)水平，分析比較兩者的動態(tài)變化。
　　結(jié)果：日本血吸蟲感染小鼠后，隨著病程的進(jìn)展，原代 H

8、SCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因的表達(dá)水平逐漸上調(diào)（1.403～5.207，1.051～5.347,1.313～3.614，gene/β-actin）。ICOS-Tg小鼠原代 HSCs中，α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因的表達(dá)水平（1.760～5.753，1.258～6.262,1.488～4.470，gene/β-actin）顯著高于同時(shí)期FVB/NJ小鼠的表達(dá)水平。

9、　　結(jié)論：共刺激信號 ICOSL/ICOS的上調(diào)，能夠促進(jìn) HSCs的活化以及肝纖維的發(fā)展。
　　三、共刺激信號ICOSL/ICOS對肝纖維化形成TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)分子基因表達(dá)水平的影響
　　目的：探討共刺激信號ICOSL/ICOS的上調(diào)，對感染日本血吸蟲ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠肝纖維化形成TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)分子基因表達(dá)水平的影響。
　　方法：應(yīng)用Trizol Reagent

10、抽提培養(yǎng)7d原代HSCs的總RNA，采用Real-time PCR法檢測ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因的表達(dá)水平；應(yīng)用RNAiso for Small RNA抽提培養(yǎng)7d原代HSCs的Small RNA，采用Real-time PCR法檢測ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs microRNA-21、microRNA-454基因的表達(dá)水平，分

11、析比較兩者的動態(tài)變化
　　結(jié)果：日本血吸蟲感染小鼠后，原代HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3、miR-21基因表達(dá)水平，自感染后4周開始上升，感染后7周達(dá)到較高水平，感染后9周有所下降，但是仍維持在較高的水平；ICOS-Tg小鼠原代HSCs中，TGF-β1、Smad2、Smad3、miR-21基因表達(dá)水平顯著高于同時(shí)期FVB/NJ小鼠的表達(dá)水平（P<0.05）。此外，隨著病程的進(jìn)展，原代HSCs中Smad4基因的表達(dá)水

12、平逐漸上調(diào)；ICOS-Tg小鼠原代HSCs中，Smad4基因表達(dá)水平顯著高于同時(shí)期FVB/NJ小鼠的表達(dá)水平（P<0.05）。但是，原代HSCs中 Smad7及miR-454基因的表達(dá)水平總體呈下調(diào)趨勢，僅在感染后4周時(shí)Smad7基因表達(dá)水平略有升高；ICOS-Tg小鼠原代HSCs中，Smad7及 miR-454基因的表達(dá)水平顯著低于同時(shí)期 FVB/NJ小鼠的表達(dá)水平（P<0.05）。
　　結(jié)論：共刺激信號 ICOSL/ICOS在