DNA甲基化與MeCP2在大鼠肝纖維化中的作用及其分子作用機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化是多種慢性致病因素作用于肝臟引起 ECM過(guò)量沉積的創(chuàng)傷愈合過(guò)程,激活的HSC是產(chǎn)生ECM的主要來(lái)源細(xì)胞。HSC活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此針對(duì)HSC的抗肝纖維化治療成為治療肝纖維化的關(guān)鍵步驟。目前針對(duì)肝纖維化的治療主要集中于抑制HSC活化及膠原合成、促進(jìn)膠原降解等幾方面。目前研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在HSC活化過(guò)程中具有重要作用。為了進(jìn)一步探討DNA甲基化在肝纖維化中的作用機(jī)制,應(yīng)用5-雜氮-2-脫氧胞苷(5-aza-2-de

2、oxycitydine,5-AzadC)作用于HSC,研究其對(duì)HSC活化增殖的影響及其分子機(jī)制,以揭示更多干預(yù)HSC活化的作用靶點(diǎn)。研究主要是從DNA甲基化這個(gè)角度進(jìn)行,以重要的促HSC活化的細(xì)胞因子PDGF介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為對(duì)象,以期為臨床防治肝纖維化提供新方法、新思路。研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)部分:
　　1.RASAL1在大鼠肝纖維化中的表達(dá)變化
　　CCl4皮下注射建立大鼠肝纖維化模型,正常組10只、CCl4處理組(

3、3、6、9、12W)各15只。自處理之日開(kāi)始,除正常組,其他各組雄性大鼠皮下注射50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次,共12周;正常組給予同樣劑量花生油皮下注射。12周末,取肝組織進(jìn)行病理組織學(xué)和Masson膠原染色檢測(cè),并檢測(cè)RASAL1在大鼠肝組織中的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠肝纖維化模型建立成功。在肝纖維化形成過(guò)程中RASAL1表達(dá)逐漸降低。
　　2.DNA甲基化抑制劑和MeCP2對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化增殖的影

4、響
　　應(yīng)用DNA甲基化抑制劑和RNA干擾沉默甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein2,MeCP2)以觀察對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞增殖的影響。體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6,PDGF-BB10ng/ml刺激細(xì)胞24h后,加入不同濃度的5-AzadC溫育48h,MTT法檢測(cè)5-AzadC對(duì)HSC增殖的影響,RT-PCR方法測(cè)定各組α-SMA,CollagenⅠ的mRNA表達(dá)水平;同

5、時(shí)應(yīng)用免疫印跡,免疫組化檢測(cè)肝組織MeCP2,α-SMA蛋白的表達(dá)。根據(jù)MeCP2的堿基序列設(shè)計(jì)并合成小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到HSC-T6細(xì)胞內(nèi),熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞增殖變化;Quantitative Real-Time PCR檢測(cè)α-SMA、MeCP2 mRNA的表達(dá);流式

6、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞周期的變化;Western Blot檢測(cè)α-SMA、MeCP2蛋白的表達(dá)。將MeCP2-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HSC-T6細(xì)胞內(nèi),MeCP2基因及蛋白水平明顯降低;同時(shí)α-SMA基因與蛋白的表達(dá)水平亦明顯降低;靶向封閉MeCP2基因的表達(dá)可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DNA甲基化和MeCP2可能是潛在的治療肝纖維化的治療靶點(diǎn)。
　　3.MeCP2對(duì)RASAL1表達(dá)的調(diào)控作用研究。
　

7、　肝星狀細(xì)胞(HSC)活化轉(zhuǎn)化成肌成纖維化母細(xì)胞,分泌ECM是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。前期研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用DNA甲基化抑制劑5-AzadC處理肝星狀細(xì)胞可阻止其活化增殖,并可促進(jìn)Ras-GTP酶激活樣蛋白1在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道,RASAL1甲基化與成纖維細(xì)胞活化及肝纖維化的形成密切相關(guān)。推測(cè),DNA甲基化促進(jìn)肝纖維化與RASAL1啟動(dòng)子發(fā)生甲基化,導(dǎo)致其表達(dá)下降有關(guān)。為了尋找潛在的分子機(jī)制,利用小干擾RNA沉默MeCP2,發(fā)現(xiàn)可