IDO調(diào)控Th17-Treg分化在哮喘免疫耐受中的作用研究.pdf

1、哮喘是一種嚴(yán)重的、累及全球所有年齡組患者的疾病。全球哮喘患病率逐年增加，特別是兒童人群。調(diào)查研究顯示:中國(guó)兒童哮喘患病率近20年來(lái)以每10年50％以上增幅上升。過(guò)去20年中，全球針對(duì)哮喘惡化及控制每日癥狀的費(fèi)用增加了30％，哮喘患病給人們工作、學(xué)習(xí)和生活帶來(lái)巨大的影響。因此進(jìn)行哮喘防治研究有著重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　哮喘的治療目前主要采取吸入激素治療，但吸入激素不能治愈哮喘，只能控制哮喘。世界衛(wèi)生組織(World Health Org

2、anization，WHO)及歐洲變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫學(xué)會(huì)(theEuropean Academy of Allergy and Clinical Immunology，EAACI)推薦的變應(yīng)原特異性免疫治療(SIT，allergen-specific immunotherapy)是目前唯一針對(duì)病因有效的預(yù)防治療。近年來(lái)證實(shí):Th1/Th2細(xì)胞失衡，尤其是Th2細(xì)胞的活化是哮喘發(fā)病的免疫機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié);Th17細(xì)胞類細(xì)胞因子在哮喘尤其是

3、中性粒細(xì)胞哮喘的免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)具有抑制Th2細(xì)胞活性的功能，在哮喘的防治中占有重要地位。免疫耐受是SIT中的重要環(huán)節(jié)，其中Treg起著關(guān)鍵作用，但其機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)色氨酸分解代謝的限速酶吲哚胺2，3雙加氧酶(Indoleamine2，3 dioxygenase，IDO)在外周免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，可以介導(dǎo)T細(xì)胞抑制及Treg活化，在一定條件下是T

4、h17細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)換的分子“開關(guān)”，并且在變應(yīng)原特異性免疫治療中有助于氣道免疫耐受的形成。因此推測(cè)IDO介導(dǎo)的色氨酸代謝可能通過(guò)調(diào)控Treg/Th17細(xì)胞分化參與了哮喘免疫耐受形成。
　　目的:
　　1.建立小鼠哮喘免疫耐受模型并評(píng)價(jià)。
　　2.探討IDO調(diào)控Th17/Treg分化失衡在變應(yīng)原特異性免疫治療誘導(dǎo)哮喘免疫耐受的作用。
　　方法:
　　1.小鼠哮喘免疫耐受模型的建立及評(píng)價(jià)
　　1)18

5、只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為哮喘免疫耐受模型組、哮喘對(duì)照組、正常對(duì)照組，每組6只小鼠。哮喘免疫耐受模型組小鼠予10μg OVA于0、7天腹腔注射致敏，21～25天持續(xù)5天予1 mg OVA腹部皮下注射誘導(dǎo)免疫耐受，35、36、37天予1％OVA霧化激發(fā)，42天處死小鼠取材;哮喘對(duì)照組除了省去21～25天OVA腹部皮下注射誘導(dǎo)免疫耐受外，其余同哮喘免疫耐受模型組;正常對(duì)照組則使用等量生理鹽水替代致敏及激發(fā)。
　　2)哮喘免疫耐受模

6、型評(píng)價(jià)
　　末次激發(fā)24小時(shí)后用無(wú)創(chuàng)體積描記法檢測(cè)各組小鼠氣道反應(yīng)性，42天處死小鼠取材，HE染色觀察各組小鼠肺組織病理改變，細(xì)胞計(jì)數(shù)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比率， ELISA法檢測(cè)各組小鼠外周血中OVA特異性IgE、BALF中IL-4、IL-10的濃度。
　　2.IDO調(diào)控Th17/Treg分化在變應(yīng)原特異性免疫治療哮喘誘導(dǎo)免疫耐受的作用。
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組:24只雌性BALB/

7、c小鼠隨機(jī)分為哮喘免疫耐受組、哮喘組、正常對(duì)照組、哮喘免疫耐受+1-甲基色氨酸（1-methyl-DL-tryptophan，1-MT）組，1-MT為IDO抑制劑，每組6只。哮喘免疫耐受+1-MT組:予10μg OVA于0、7天腹腔注射致敏，21～25天持續(xù)5天予1mg OVA聯(lián)合1-MT2mg腹部皮下注射，35、36、37天予1％OVA霧化激發(fā)，42天處死小鼠取材;余建模及模型評(píng)價(jià)方法同前。
　　(2) ELISA檢測(cè)各組小鼠外

8、周血中IL-4、IL-10、IL-17的濃度;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠外周血中Th17、Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞百分率情況。
　　(3)高效液相色譜法檢測(cè)哮喘免疫耐受組、哮喘組、正常對(duì)照組小鼠IDO活性。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立哮喘小鼠免疫耐受模型
　　動(dòng)物行為學(xué):哮喘免疫耐受模型組小鼠哮喘樣癥狀較哮喘組對(duì)照組明顯減低，較正常對(duì)照組小鼠加重。氣道反應(yīng)性:哮喘免疫耐受模型組小鼠氣道反應(yīng)性較哮喘對(duì)照組小鼠

9、明顯減低(p＜0.05)，但高于正常對(duì)照組。肺組織HE染色:哮喘免疫耐受模型組小鼠嗜酸性粒細(xì)胞增多等炎癥反應(yīng)較哮喘對(duì)照組小鼠明顯減輕，但高于正常對(duì)照組。BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比例:哮喘免疫耐受模型組小鼠明顯低于與哮喘對(duì)照組小鼠(p＜0.05)，但高于正常對(duì)照組。外周血中OVA特異性IgE、BALF中IL-4的濃度:哮喘免疫耐受模型組小鼠明顯低于與哮喘對(duì)照組小鼠(p＜0.05)，但高于正常對(duì)照組。BALF中IL-10的濃度哮喘免

10、疫耐受模型組小鼠明顯高于與哮喘對(duì)照組小鼠(p＜0.05)，高于正常對(duì)照組。
　　2.IDO調(diào)控Th17/Treg分化失衡參與了變應(yīng)原特異性免疫治療誘導(dǎo)哮喘免疫耐受。
　　氣道反應(yīng)性檢測(cè):哮喘免疫耐受組氣道反應(yīng)性較哮喘組明顯降低(p＜0.05)，但高于正常對(duì)照組;哮喘免疫耐受+1-MT組氣道反應(yīng)性較哮喘免疫耐受組明顯增高(p＜0.05)，但低于哮喘組。
　　肺組織HE染色:哮喘免疫耐受組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較哮喘組明顯減輕

11、，但較正常對(duì)照組加重;哮喘免疫耐受+1-MT組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較哮喘免疫耐受組明顯加重，但較哮喘組減輕。
　　BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù):哮喘免疫耐受組BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比率較哮喘組均明顯降低(p＜0.05)，但均高于正常對(duì)照組;哮喘免疫耐受+1-MT組細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比率較哮喘免疫耐受組均明顯增高(p＜0.05)，但均低于哮喘組。
　　ELISA檢測(cè)小鼠外周血中OVA特異性IgE及BALF中IL-4

12、、IL-10、IL-17的濃度:哮喘免疫耐受組BALF中IL-4、IL-17濃度較哮喘組均明顯降低(p＜0.05)，但均高于正常對(duì)照組;哮喘免疫耐受+1-MT組IL-4、IL-17濃度較哮喘免疫耐受組均明顯增高(p＜0.05)，但均低于哮喘組。哮喘免疫耐受組BALF中IL-10濃度較哮喘組明顯增高(p＜0.05)，較正常對(duì)照組增高;哮喘免疫耐受+1-MT組IL-10濃度較哮喘免疫耐受組明顯減低(p＜0.05)，但高于哮喘組。
　　

13、流式細(xì)胞法檢測(cè)小鼠外周血Th17、Treg占CD4+細(xì)胞的百分率變化:哮喘免疫耐受組Th17細(xì)胞比率較哮喘組明顯減低(p＜0.05)，但高于正常對(duì)照組;哮喘免疫耐受+1-MT組Th17細(xì)胞比率較哮喘免疫耐受組明顯增高(p＜0.05)，但低于哮喘組。哮喘免疫耐受組Treg細(xì)胞比率較哮喘組明顯增高(p＜0.05)，高于正常對(duì)照組;哮喘免疫耐受+1-MT組Treg細(xì)胞比率較哮喘免疫耐受組明顯降低(p＜0.05)，但高于哮喘組。
　　高效

14、液相色譜法檢測(cè)小鼠外周血IDO活性:哮喘免疫耐受組IDO活性較哮喘組明顯增高(p＜0.05)，高于正常對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.大劑量OVA連續(xù)皮下注射致敏小鼠成功建立了小鼠哮喘免疫耐受模型。
　　2.哮喘發(fā)病中存在Th17/Treg失衡，SIT治療哮喘誘導(dǎo)免疫耐受中Th17/Treg失衡得以逆轉(zhuǎn)。
　　3.IDO通過(guò)調(diào)控Th17/Treg分化可誘導(dǎo)哮喘免疫耐受，有望通過(guò)調(diào)控IDO表達(dá)誘導(dǎo)免疫耐受以防治哮喘。