IDO基因修飾未成熟DC誘導(dǎo)哮喘免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。“Th1/Th2偏移”假說被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的主要免疫學(xué)機(jī)制，該假說認(rèn)為Th2細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[3-5]。正常人接觸過敏原后不會發(fā)生Th2細(xì)胞的過度活化，這是因?yàn)檎Ｈ丝梢詫^敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接

2、觸過敏原后T細(xì)胞異?；罨鲋澈头只癁門h2細(xì)胞，引起“Th1/Th2偏移”，始動哮喘的氣道炎癥。 吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)是色氨酸分解代謝的限速酶，可形成局部低色氨酸環(huán)境，抑制活化的CD4+T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫耐受。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是目前已知功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)，它既是氣道變應(yīng)性

3、炎癥的始動因素，也可能是介導(dǎo)免疫耐受的樞紐環(huán)節(jié)，在激發(fā)免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受兩方面均起關(guān)鍵作用。 本研究應(yīng)用pEGFP-N1-IDO基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC，并觀察IDO基因?qū)β训鞍字旅?激發(fā)小鼠模型CD4+T細(xì)胞的影響；將pEGFP-N1-IDO基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC移入卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道，觀察對其氣道炎癥的影響，為臨床防治哮喘提供新的思路。 研究內(nèi)容和方法： 1.小鼠IDO基因的克隆及載體

4、構(gòu)建：RT-PCR法擴(kuò)增IDOcDNA全長基因序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1上。 2.未成熟DC的分離、培養(yǎng)和鑒定：體外擴(kuò)增小鼠骨髓來源的未成熟DC，采用光鏡、掃描電鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞技術(shù)鑒定CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子。 3.小鼠IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC中目的基因表達(dá)的鑒定：應(yīng)用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC,轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠

5、色熒光，用RT-PCR、Western-blot法鑒定基因轉(zhuǎn)染未成熟DC中目的基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況。 4.pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的影響。 5.建立卵蛋白(OVA)致敏/激發(fā)小鼠模型：腹腔注射OVA和霧化吸入OVA途徑來致敏/激發(fā)和激發(fā)小鼠，觀察BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)、BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ，水平，病理切片觀察小

6、鼠肺部氣道炎癥變化。 6.IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC對卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞增殖、凋亡和分泌細(xì)胞因子的影響：分離卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，分別與pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對未成熟DC共培養(yǎng)后，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和TUNEL法檢測CD4+T細(xì)胞增殖、凋亡情況，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的變化。 7.IDO基因轉(zhuǎn)染未成

7、熟DC對卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥的影響：將IDO基因轉(zhuǎn)染的未成熟DC經(jīng)氣管注入卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠體內(nèi)，病理切片觀察小鼠肺部氣道炎癥變化，進(jìn)行BALF細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)，ELISA檢測BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平。 結(jié)果： 1.用RT-PCR法成功擴(kuò)增出mIDOcDNA全長序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1得pEGFP-N1-IDO，測序后序列完全正確。 2.獲得小鼠骨髓來源的未

8、成熟DC。 3.應(yīng)用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC后，pEGFP-N1-IDO轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，而對照組沒有綠色熒光，RT-PCR可檢測到相應(yīng)目的基因mRNA的表達(dá)，Westernblot法可檢測到相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)，而pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組和對照組不能檢測到IDO的mRNA和蛋白的表達(dá)。 4.pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體

9、轉(zhuǎn)染對未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)無影響，仍以未成熟型為主。 5.成功建立卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型，BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)增高、BALF中IL-4、IL-5的水平增高和IFN-γ水平降低，病理切片觀察卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型病理切片肺部氣道炎癥變化。 6.IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹突細(xì)胞能抑制卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型CD4+T細(xì)胞增殖，pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CD4+T細(xì)

10、胞減少，與和pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹突細(xì)胞可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡，pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CD4+T細(xì)胞凋亡率為15.3％±2.6％，較對照組和pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著增加(P＜0.01)。pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高。 7.IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC能顯著地減輕卵蛋白

11、致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥，減少BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)、降低BALF中IL-4、IL-5的水平和增高IFN-γ水平。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建IDO基因高表達(dá)的未成熟DC細(xì)胞模型。 2.IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC在體外能誘導(dǎo)OVA致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞呈低反應(yīng)性，能抑制OVA致敏/激發(fā)小鼠Th2細(xì)胞活化；IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡。 3.IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC在OVA致敏/