HLA-G基因修飾及磁靶向趨化BM-MSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受的研究.pdf

1、背景：
　　腎移植被公認(rèn)為治療終末期腎病的最佳方式，每年全世界有數(shù)萬計的尿毒癥患者進行腎移植手術(shù)。腎移植術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)以及各種原因引起的慢性移植腎病是臨床上制約移植腎長期存活的關(guān)鍵因素。目前研究認(rèn)為誘導(dǎo)機體對于移植腎的免疫耐受是解決上述問題的最理想方式。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derivedmesenchyme stem cells，BM-MSCs)由于具有獨特的免疫調(diào)節(jié)作用及多向分化潛能，被認(rèn)為是誘導(dǎo)免疫

2、耐受、減輕及修復(fù)移植腎免疫損傷的理想工具。但是應(yīng)用到動物模型中后，研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs在體的免疫抑制效應(yīng)偏弱，在腎移植模型中應(yīng)用時并不能明顯減少免疫抑制劑的應(yīng)用。并且由于缺乏向移植腎的靶向機制以及肺、肝等靜脈池的滯留效應(yīng)，BM-MSCs輸注體內(nèi)之后，只有極少數(shù)能夠到達移植腎部位，無法在局部發(fā)揮免疫保護、組織修復(fù)等效應(yīng)。因此，迫切需要研究如何提高BM-MSCs本身的免疫抑制效應(yīng)以及增加在移植腎局部的聚集，以縮小BM-MSCs從基礎(chǔ)研究到

3、腎移植臨床應(yīng)用的距離。
　　目的：
　　本研究擬通過慢病毒載體將具有明確免疫抑制效應(yīng)的HLA-G基因轉(zhuǎn)染到BM-MSCs中，觀察能否使其細胞表面大量表達HLA-G分子，并在體外驗證其免疫抑制效應(yīng)是否得到增強。為使轉(zhuǎn)染HLA-G后輸注到體內(nèi)的BM-MSCs能夠聚集在移植腎局部發(fā)揮效應(yīng)，本研究擬使BM-MSCs吞噬超順磁納米鐵顆粒(Super-paramagnetic ironoxide，SPIO)后帶有磁性，在移植腎局部應(yīng)用強

4、磁場，觀察能否使BM-MSCs在移植腎局部聚集并發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。本研究擬為BM-MSCs在腎移植領(lǐng)域的應(yīng)用提供一種新思路。
　　方法：
　　1、穿刺兔股骨獲得骨髓，使用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞。應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法獲得BM-MSCs。誘導(dǎo)向成骨、成脂細胞方向分化。流式細胞術(shù)鑒定BM-MSCs表面分子標(biāo)志。
　　2、化學(xué)合成HLA-G基因，PCR擴充，與慢病毒載體一起進行酶切及連接，行Real-time PCR鑒定和

5、測序，構(gòu)建HLA-G慢病毒表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染293T細胞后收集含病毒上清后濃縮，Real-time PCR測定病毒滴度。攜帶HLA-G的慢病毒載體感染BM-MSCs，觀察綠色熒光表達，獲取最合適的MOI值。WB法檢測細胞膜型HLA-G表達水平。ELISA法檢測上清中分泌型HLA-G水平。
　　3、建立混合淋巴細胞培養(yǎng)體系，通過BM-MSCs與淋巴細胞共培養(yǎng)，驗證轉(zhuǎn)染了HLA-G的BM-MSCs（之后描述為HLA-G-BM-MSCs）的

6、功能學(xué)效應(yīng)特點。應(yīng)用免疫磁珠從培養(yǎng)體系中分離出CD4+T細胞，檢測其凋亡情況，并通過WB法檢測其細胞周期相關(guān)蛋白的表達。
　　4、應(yīng)用SPIO孵育HLA-G-BM-MSCs，使其帶有磁性。建立兔同種異體腎移植模型，在移植腎部位安放體外強磁場，形成磁場的趨化。將吞噬了SPIO的BM-MSCs輸注體內(nèi)，病理切片觀察BM-MSCs能否更多地聚集到移植腎。觀察與環(huán)孢素相比，其免疫抑制效應(yīng)如何。
　　結(jié)果：
　　1、密度梯度離心

7、及貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出兔BM-MSCs。細胞生長旺盛，可連續(xù)傳代15次以上，形態(tài)呈典型梭狀，漩渦狀生長。在成骨、成脂誘導(dǎo)下，能夠成功分化為成骨及成脂細胞。流式細胞BM-MSCs表面抗原示CD90表達陽性，CD14表達陰性。
　　2、成功構(gòu)建攜帶HLA-G基因的慢病毒轉(zhuǎn)染體系，病毒滴度達到2x109TU/ml。攜帶HLA-G的慢病毒成功感染BM-MSCs，確定最佳MOI值為50。轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達強，傳代10次以上仍然可以穩(wěn)定表

8、達綠色熒光。WB顯示BM-MSCs大量表達HLA-G分子。ELISA法顯示BM-MSCs并不產(chǎn)生分泌型的HLA-G。
　　3、成功建立兔BM-MSCs與人PBMC的Transwell共培養(yǎng)體系。結(jié)果顯示HLA-G-BM-MSCs能夠明顯抑制淋巴細胞增殖反應(yīng)，抑制率達到61.2％。這種抑制效應(yīng)是在與淋巴細胞發(fā)生接觸時產(chǎn)生的，Transwell上室中未與HLA-G-BM-MSCs發(fā)生接觸的淋巴細胞增殖不受抑制。凋亡檢測顯示共培養(yǎng)體系中

9、的CD4+T細胞并沒有出現(xiàn)明顯凋亡，而是停留在G0/G1期，未能進入增殖期，WB檢測顯示相關(guān)的細胞周期蛋白cyclin D2、cyclin D3以及CDK等表達明顯減少。
　　4、成功使HLA-G-BM-MSCs吞噬SPIO，吞噬后細胞形態(tài)、增殖能力等不受影響。電鏡顯示細胞內(nèi)溶酶體中大量鐵顆粒存在。熒光顯微鏡示發(fā)綠色熒光的BM-MSCs內(nèi)部含有大量紅色熒光的SPIO顆粒。在體外BM-MSCs能夠在強磁場中發(fā)生定向運動。輸注體內(nèi)之后

10、，應(yīng)用移植腎局部的外在強磁場能夠使更多的BM-MSCs聚集到腎臟部位。其免疫抑制效應(yīng)明顯增強，稍弱于環(huán)孢素應(yīng)用的效果，但是明顯強于不施加磁靶向的組別。
　　結(jié)論：
　　1、密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法獲得兔BM-MSCs，經(jīng)分化鑒定及流式鑒定符合BM-MSCs標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、應(yīng)用慢病毒載體將HLA-G基因轉(zhuǎn)染至BM-MSCs細胞，HLA-G基因能夠正確、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄和表達。
　　3、體外實驗中，HLA-G-BM-MSC