CCR7基因修飾未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)供體大鼠骨髓來(lái)源的未成熟樹突狀細(xì)胞（immature dendritic cell，imDC），使用趨化因子受體7(chemokine receptor7，CCR7)基因重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染imDC，研究其對(duì)大鼠同種異體高危角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響，探討其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。
　　方法：通過聯(lián)合應(yīng)用重組大鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulat

2、ing factor，GM-CSF）和白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-4體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增大量的imDC，通過細(xì)胞形態(tài)及表型對(duì)其加以鑒定；將攜帶大鼠CCR7基因的重組腺病毒通過增強(qiáng)離心法轉(zhuǎn)染imDC，對(duì)轉(zhuǎn)染后的imDC再次進(jìn)行形態(tài)及表型鑒定，并通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CCR7的表達(dá)；以60只SD大鼠作為受體，30只Wistar大鼠作為供體，通過堿燒傷建立高危角膜移植模型；采用隨機(jī)數(shù)字表法將受體SD大鼠分為空白對(duì)照組、未修飾im

3、DC組（imDC組）、imDC+空載體腺病毒組(imDC+Ad組)和 imDC+CCR7腺病毒組(imDC+Ad-CCR7組)，每組各15只；各組受體術(shù)前7d和術(shù)后3d分別經(jīng)尾靜脈注入PBS液、供體來(lái)源的未修飾imDC、空載體腺病毒轉(zhuǎn)染后的imDC和攜帶CCR7基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后的imDC(1×107個(gè)/只，細(xì)胞懸浮于0.1ml PBS液中，空白對(duì)照組只注入等量PBS液)；術(shù)后每日在裂隙燈下觀察角膜植片的存活情況并評(píng)分，術(shù)后14d每組隨

4、機(jī)處死6只受體大鼠，取角膜植片行HE切片觀察以及通過RT-PCR檢測(cè)Th1型細(xì)胞因子IL-2、干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：培養(yǎng)的imDC經(jīng)過倒置相差顯微鏡及掃描電鏡的形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀進(jìn)行的免疫學(xué)表型檢測(cè)，可證實(shí)為實(shí)驗(yàn)所需的imDC；細(xì)胞免疫熒光顯示imDC不表達(dá)CCR7，imDC經(jīng)空載體腺病毒轉(zhuǎn)染后不表達(dá)CCR7,經(jīng)CCR7腺病毒轉(zhuǎn)染后

5、CCR7表達(dá)增加；角膜移植術(shù)后，imDC+Ad-CCR7組大鼠角膜植片的混濁、水腫及新生血管程度評(píng)分較其他組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；角膜植片平均存活時(shí)間（MST）：imDC+Ad-CCR7組較對(duì)照組、imDC組和imDC+Ad組顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；角膜HE切片顯示，imDC+Ad-CCR7組植片輕度水腫、基質(zhì)層板層纖維排列有序，imDC組和imDC+Ad組呈不同程度水腫，基質(zhì)層板層纖維排列輕

6、度紊亂、有少量的炎性細(xì)胞；空白對(duì)照組的植片高度水腫、角膜基質(zhì)板層纖維紊亂，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞和新生血管；RT-PCR顯示：imDC+Ad-CCR7組Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組、imDC組和imDC+Ad組明顯降低；Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10 mRNA的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.05）。
　　結(jié)論：通過腺病毒增強(qiáng)離心法轉(zhuǎn)染imDC可使CCR7基因有效轉(zhuǎn)入imDC并表達(dá)CCR