FasL和TGF-β1基因共修飾樹突狀細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究.pdf

1、肝移植已成為各種良性終末期肝病及早期、中期肝癌有效的治療方法，然而，急性排斥反應(acute rejeetion，AR)仍是肝移植術后主要的并發(fā)癥之一。未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells，imDC)可誘導抗原特異性T細胞低反應性并延長移植器官的存活時間；但它可能在活體內(nèi)復雜的微環(huán)境中接受成熟信號而被誘導成熟，甚至會加重排斥反應。具有免疫抑制功能的單基因修飾imDC的基礎研究已證實可增強imDC誘導免疫耐受

2、的能力，也表現(xiàn)出一定的局限性，未能達到理想的免疫耐受狀態(tài)。本研究采用聯(lián)合具有不同免疫抑制功能的雙基因共同修飾imDC，以進一步提高imDC誘導免疫耐受的能力，從而獲得受者的長期生存。 目的: 聯(lián)合FasL和TGF-β1基因共修飾大鼠骨髓來源的imDC，旨在進一步提高imDC誘導大鼠同種異體原位肝移植免疫耐受的能力，以延長受鼠生存期。 方法: 1.建立改良的大鼠原位肝移植模型：在原二袖套法的基礎上，采用快速

3、切取供肝，一針法連續(xù)縫合肝上下腔靜脈以及對出血點進行熱止血等方法，進行120例大鼠原位肝移植，并觀察術后存活率。 2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反應模型：大鼠原位肝移植分3種移植組合：SD→SD組(同基因?qū)φ战M)，SD→Wistar組及DA→Lewis組，每組合20例。分別于術后3、5、7和10d各隨機處死4只，觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL)與肝臟病理改變，各組除外技術死亡的受鼠，將余受鼠留做生存分析。 3.培

4、養(yǎng)和誘導DA大鼠骨髓來源的DC，經(jīng)形態(tài)學、免疫表型及功能鑒定確認后，將構建好的pIRES2-EGFP-hFasL和plRES2-EGFP-hTGF-β1質(zhì)粒共轉染到imDC，檢測hFasL和hTGF-β1的表達。 4.將空載體轉染的DA大鼠imDC分別從尾靜脈注射(尾靜脈注射組，20只)和腹腔注射(腹腔注射組，20只)至Lewis大鼠體內(nèi)，兩組分別于注射后第1d、2d、3d、5d及7d各時間點處死4只大鼠，取胸腺、脾臟、腹腔淋巴

5、結、肝臟及腎臟組織行冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)并分析。 5.行以DA大鼠為供體、近交系Lewis大鼠為受體的同種異體原位肝移植140例，隨機均分為7組：未注射DC組(對照組)、mDC組、imDC組、空載體組、FasL組、TGF組及共轉染組；分別于移植前5d每天給Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空載體轉染的imDC、hFasL修飾的imDC、hTGF-β1修飾的imDC、hFasL和hTGF-β1共修飾的imDC各

6、2x106個，于肝移植術后3d、7d、10d各處死4只，觀察外周血肝功能變化(AtT和TBIL)，肝臟病理改變，肝、脾及腹腔淋巴結凋亡情況，外周血清細胞因子情況，各組除去技術死亡的受鼠，將余下受鼠作生存分析，死亡時取肝臟行病理組織學檢查。 結論: 1.經(jīng)改良的大鼠原位肝移植方法，手術時間短，成功率高，穩(wěn)定可靠，建立了比較穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型，適用于肝移植方面的基礎研究。 2.SD→Wistar組合的大鼠原位

7、肝移植模型雖可產(chǎn)生急性排斥反應，但發(fā)展相對慢，且會出現(xiàn)自發(fā)性免疫耐受，因而并非肝移植急性排斥反應基礎研究理想的動物模型；DA→Lewis組合的大鼠原位肝移植術后肝臟病理改變、肝功能的變化及生存時間均符合臨床上肝移植術后急性排斥反應的特點，是研究肝移植急性排斥反應理想的動物模型。 3.本實驗能培養(yǎng)、誘導、擴增大量的DC。hFasL或hTGF-β1基因轉染均能夠獲得有效的表達，轉染后對imDC表型沒有明顯影響：可明顯降低imDC對同

8、種異體T淋巴細胞的反應性。聯(lián)合FasL和TGF-β1基因轉染的imDC在體外誘導同種異體免疫耐受的能力強于FasL或TGF-β1單基因轉染。 4.腹腔注射時imDC在體內(nèi)的分布主要以主動遷移為主，速度相對慢，避免了尾靜脈注射時大量imDC快速分布在肝臟，以及切除受體肝臟時其內(nèi)的imDC丟失，該途徑適于肝移植免疫耐受的基礎研究。 5.imDC、hFasL或hTGF-β1單基因修飾imDC均未能誘導同種異體大鼠肝移植長期存活