IL-10和TGF-β1基因共修飾樹突狀細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究.pdf

1、肝移植是目前治療終術期良性肝病的效治療手段。肝移植的理想目標是要達到移植肝和受體之間的免疫耐受，既在低免疫抑制或無免疫抑制的情況下移植物仍然功能正常。免疫抑制劑的使用短期內(nèi)能改善急性排斥癥狀，但不能保證移植物長期存活，此外免疫抑制劑的長期使用常導致嚴重的副作用，因此我們尋找有效的在不使用免疫抑制劑的情況下，使受者機體對于移植物產(chǎn)生特異性的耐受已經(jīng)成為移植免疫學領域最為關注的問題方法，因此，本研究通過對樹突狀細胞及其基因工程改造，探討它們

2、與肝移植耐受的關系，從而為無限期延長移植物的存活提供新的治療方案。 在免疫耐受的誘導中，樹突狀細胞(dendritic cell，Dc)起重要的作用，現(xiàn)在已知DC是體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells,APC)，在機體的特異性免疫中起著非常重要的作用。目前研究證實，DC在啟動免疫反應和誘導免疫耐受起決定性作用，這取決于其成熟狀態(tài)，不成熟DC表面缺乏或低表達MHC分子和共刺激分子，導致T細胞

3、的無能和低反應，從而誘導抗原特異性免疫耐受，而成熟DC表面高表達Mt{C分子和共刺激分子能激活參與免疫反應的淋巴細胞的增生，因此對DC進行改造以誘導移植免疫耐受成為研究的熱點和關鍵領域。 白介素-10(interleukin-10，IL-10)可抑制Th.1激活的抗原提呈細胞合成細胞因子，阻止單核巨噬細胞活化和抗原提呈細胞的功能。因此，可以抑制炎性免疫反應和T細胞介導的免疫反應。從而減輕免疫排斥反應有很重要的意義。 轉(zhuǎn)化

4、生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種強效免疫抑制因子，它可以抑制細胞毒性T淋巴細胞的增殖和活化，抑制T，B淋巴細胞的增殖及免疫球蛋白的分泌，調(diào)節(jié)多種細胞因子如IL-1，IL-2的生成并拮抗它們的功能。因此，它在移植免疫過程中，對移植物的長期存活和移植物的耐受密切相關。 由于IL-10和TGFβ1既是誘導耐受DC形成的重要細胞因子，又是參與誘導移植耐受的重要細胞因子，所以

5、我們通過從大鼠骨髓分離造血前體細胞體外誘導培養(yǎng)足夠數(shù)量的DC，構(gòu)建IL-10和TGFβ1重組質(zhì)粒，并將其單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染大鼠imDC，研究IL-10和TGFβ1單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染后的imDC輸注后在受者體內(nèi)的遷移途徑，以及對于同種異體大鼠移植肝的排斥反應級別和存活時間的影響，探討它們誘導移植耐受的機制。 目的: 通過基因工程改造DC，建立肝移植動物模型，構(gòu)建IL-10和TGβ1重組質(zhì)粒，研究IL-10和TGFβ1單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染

6、的DC輸注受者體內(nèi)的遷移途徑，以及對于同種異體大鼠移植肝的排斥反應級別和存活時間的影響，探討DC誘導移植耐受的機制，為臨床治療移植免疫排斥提供了有力的實驗基礎和有關理論上的依據(jù)。 方法: 1.DA大鼠DC的誘導、培養(yǎng)及鑒定：用不同細胞因子誘導培養(yǎng)大鼠骨髓來源的造血前體細胞成為成熟DC(mature DC，mDC)和不成熟DC(immature DC，imDC)，利用電鏡等進行形態(tài)學觀察鑒定、利用流式細胞法和免疫組化法進行

7、表型鑒定，利用混合淋巴細胞反應和動物體內(nèi)直接注射DC進行功能學鑒定。 2.構(gòu)建、篩選、擴增、抽提和鑒定plRES2-EGFP-hlL-10和plRES2-EGFP-hTGFβ1真核表達質(zhì)粒：(1)RT-PCR擴增人IL-10基因，1％瓊脂糖凝膠電泳分離、回收PCR產(chǎn)物，含plRES2-EGFP空載體，經(jīng)XhoⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切后，T4DNA連接酶連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5a感受態(tài)細胞。挑取單克隆菌落進行擴增培養(yǎng)提質(zhì)粒，以Xho

8、Ⅰ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定。將雙酶切為陽性的質(zhì)粒plRES2-EGFP-hiL10送公司測序。(2)hTGFβ1構(gòu)建方法同前，以BglⅡ和HindⅢ進行雙酶切鑒定。(3)用中抽試劑盒抽提質(zhì)粒，以紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度。 3.脂質(zhì)體介導的pIRES2-EGFP-hlL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染imDC細胞：收集培養(yǎng)6天的imDC，按照Lipofect鋤ine2000使用說明進行轉(zhuǎn)染。實驗設立

9、空載體轉(zhuǎn)染組、IL-10、TGFβ1轉(zhuǎn)染組和共轉(zhuǎn)染組，48hr熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在imDC中的表達。 4.用5種方法檢測轉(zhuǎn)染后各組imDC分子表型和免疫功能的變化：(1)ELISA法和(2)Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組imDC培養(yǎng)上清IL-10、TGFβ1蛋白表達；(3)流式細胞法檢測各組imDC表面分子CD80、CD86表達情況； (4)免疫細胞化學法檢測各組imDC MHCll分子表達情況；(5)混

10、合淋巴細胞反應法檢測各組imDC對T細胞的增殖作用。 5.大鼠肝移植模型構(gòu)建：受體為Lewis；大鼠，供體為DA大鼠，采用二袖套法建立肝移植模型。 6.IL-10、TGFβ1單基因和聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DC輸注對于同種異體Lewis大鼠移植肝耐受的實驗研究： (1)探討plRES2-EGFP-DC腹腔和尾靜脈輸注后在受體Lewis體內(nèi)的遷移途徑以及微嵌合體形成的機制；(2)IL-10、TGFβ1單基因和聯(lián)合轉(zhuǎn)染的imDC移植前5d

11、輸注受體Lewis大鼠體內(nèi)，移植后分別于3d、7d、10d：1)檢測肝功能；2)E1ASA法檢測各組IL-12水平；3)肝臟蘇木精伊紅(HE)染色及急性排斥反應病理評分；4)TUNEL法檢測肝臟、脾和淋巴結(jié)采用淋巴細胞的凋亡情況。(3)觀察各組大鼠肝移植后的生存時間。 7.統(tǒng)計學處理：應用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析，p<0.05為具有顯著性差異。 結(jié)論: 1.本實驗已成功利用細胞因子從大鼠骨髓造血干細

12、胞誘導出足夠數(shù)量的mDC和imDC。同時，mDC和imDC具有不同的生物學特性。 2.我們在成功構(gòu)建plRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1真核表達質(zhì)粒的基礎上，采用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染imDC，可以獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)入的基因可以在imDC內(nèi)表達，并且使imDC的生物學特性發(fā)生相應的改變。 3.本實驗采取基因共轉(zhuǎn)染技術，發(fā)現(xiàn)IL-10和TGFβ1共轉(zhuǎn)染對誘導大鼠移植免疫耐受作用和延長移植