CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞誘導哮喘免疫耐受的實驗研究.pdf

1、第一部分腺病毒轉導CTLA4Ig基因修飾樹突狀細胞
　　 目的：構建CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞，觀察基因轉導對樹突狀細胞表型的影響。
　　 方法：小鼠骨髓來源的細胞懸液，在GM-CSF和IL-4作用下，體外培養(yǎng)7天。光學顯微鏡下觀察細胞生長狀況和形態(tài)學變化。流式細胞儀鑒定細胞表型，確定是否為樹突狀細胞及其成熟度。確定為樹突狀細胞后，與重組腺病毒AdCTLA4Ig、AdGFP以及OVA共孵育48小時，熒光顯微鏡觀察

2、細胞內(nèi)目的基因表達，流式細胞儀測定轉染效率。
　　 結果：1、小鼠骨髓來源的細胞培養(yǎng)第7天可見樹突狀細胞特征性的樹枝狀形態(tài)和細胞集落形成。2、流式檢測發(fā)現(xiàn)64.01％的細胞為CD11c陽性的未成熟的DC；33.49％的細胞為CD11c+CD80+細胞；14.65％的細胞為CD11c+CD86+細胞；21.53％的細胞為CD11c+MHCⅡ+細胞。3、與重組腺病毒和OVA共孵育48小時后，熒光顯微鏡下可觀察到樹突狀細胞內(nèi)發(fā)出綠色熒

3、光。流式細胞儀分析檢測顯示AdCTLA4Ig轉染率為41.29％。4、與重組腺病毒和OVA共孵育48小時后，流式細胞儀檢測顯示42.65％的細胞為CD11c+CD80+細胞；22.30％的細胞為CD11c+CD86+細胞；32.46％的細胞為CD11c+MHCⅡ+細胞。
　　 結論：成功構建了CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞。
　　 第二部分 CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞的體外功能研究
　　 目的：研究C

4、TLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞在體外的功能，了解CTLA4Ig轉染對樹突狀細胞表達細胞因子IL-10、IL-12的影響以及對刺激T細胞活化增殖功能的影響。
　　 方法：分離和培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DC。將體外培養(yǎng)7天的樹突狀細胞分成4組，一組為DC組，一組為DC+OVA組，另外兩組分別加入1μl病毒滴度為1.5×108VP/ml的AdGFP或AdCTLA4Ig和OVA。這4組細胞分別共培養(yǎng)48小時后，分離細胞和上清。上清用ELIS

5、A方法檢測IL-10和IL-12。細胞用于和BALB/c小鼠外周血來源的T淋巴細胞進行混合淋巴細胞反應。
　　 結果：1、CTLA4Ig基因轉染樹突狀細胞后，促進樹突狀細胞分泌IL-10(P<0.05)。
　　 2、CTLA4Ig基因轉染樹突狀細胞后，降低樹突狀細胞分泌IL-12的能力(P<0.05)。
　　 3、CTLA4Ig基因轉染樹突狀細胞后，樹突狀細胞促T淋巴細胞增殖的能力下降(P<0.05)。
　

6、　 結論：CTLA4Ig基因轉染樹突狀細胞高表達IL-10，低表達IL-12，促T細胞增殖的能力降低。
　　 第三部分新生小鼠回輸CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞抑制成年期氣道過敏性炎癥
　　 目的：研究將CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞回輸給新生小鼠，觀察其對成年期OVA致敏/激發(fā)的小鼠氣道炎癥的影響，并探討其發(fā)病機制。
　　 方法：以OVA腹腔注射致敏小鼠并霧化吸入激發(fā)的方法制作哮喘模型。將CTLA4I

7、g基因修飾的樹突狀細胞回輸給新生的BALB/c小鼠，在成年期OVA致敏/激發(fā)小鼠，觀察CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞對小鼠氣道炎癥的影響。同樣方法設立對照組AdGFP干預組，另設立空白對照組、哮喘模型組。通過觀察各組小鼠OVA激發(fā)時的表現(xiàn)、肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒細胞比例和肺部病理切片改變了解小鼠氣道炎癥情況。ELISA方法測定血清及BALF的IgE、IL-4、IL-10及INF-γ水平。
　　 結果：1、OVA腹腔注

8、射致敏小鼠并霧化吸入激發(fā)的方法能成功制作哮喘模型。2、新生小鼠給予CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞明顯減輕成年期哮喘發(fā)作的癥狀、減少肺泡灌洗液中嗜酸性細胞的生成和病理切片中的炎癥表現(xiàn)。3、CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞可以減輕成年期小鼠哮喘發(fā)作時的血清和肺泡灌洗液中IgE水平。4、CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞可減輕成年期小鼠哮喘發(fā)作時的血清和肺泡灌洗液中IL-4水平。5、CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細胞可提高成年期小鼠血清