重組CTLA4Ig和CCR7誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞治療哮喘的研究.pdf

1、本文就重組CTLA4Ig和CCR7誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞治療哮喘進(jìn)行了研究，主要從以下幾部分展開： 第一部分小鼠CCR7基因克隆 目的：從小鼠肺臟克隆出CCR7基因，為下一步利用腺病毒載體AdEasy system構(gòu)建AdCCR7打下基礎(chǔ)。 方法：以小鼠肺臟提取的總RNA為模板，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增小鼠CCR7基因的特異性引物，加入特定的酶切位點(diǎn)，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用膠回收法純化目的基因CCR7，目的基因定向克隆至

2、載體pMD-19，構(gòu)建質(zhì)粒pMD-CCR7，進(jìn)行測(cè)序，與已知GeneBank中的CCR7基因進(jìn)行序列比較，若有對(duì)導(dǎo)致編碼氨基酸改變的突變堿基則進(jìn)行定點(diǎn)突變修復(fù)。 結(jié)果：克隆CCR7基因，序列測(cè)定表明CCR7基因有2個(gè)堿基突變，但不造成編碼氨基酸的改變，無需進(jìn)行突變堿基定點(diǎn)修復(fù)。 結(jié)論：本研究成功克隆小鼠CCR7基因，確定無造成編碼氨基酸改變的突變堿基，無需進(jìn)行突變堿基定點(diǎn)修復(fù)。 第二部分構(gòu)建重組腺病毒AdCTLA

3、4Ig、AdCCR7 目的：應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)AdEasy System構(gòu)建含有CTLA4Ig、CCR7基因的重組腺病毒AdCTLA4Ig、AdCCR7及其對(duì)照腺病毒AdGFP，為進(jìn)一步應(yīng)用其進(jìn)行誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫耐受并回歸到肺組織的研究打下基礎(chǔ)。 方法：1.將目的基因CTLA4Ig克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組

4、，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdCTLA4Ig。2.將穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV直接酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdGFP。3.將目的基因CCR7克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdCCR7。將以上構(gòu)建的重組腺病毒質(zhì)粒以PacⅠ酶切法

5、進(jìn)行鑒定。成功重組的腺病毒質(zhì)粒用PacⅠ線性化后轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞HEK293，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光以確定轉(zhuǎn)染效率，用RT-PCR.法鑒定構(gòu)建效果。 結(jié)果：重組腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdGFP和pAdCCR7分別經(jīng)PacⅠ酶切后可見4.5Kb或3Kb和一條30Kb的條帶，表明同源重組成功。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞HEK293后于熒光顯微鏡下可觀察到明亮的綠色熒光。將收集的病毒液做RT-PCR鑒定，結(jié)果

6、表明重組腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdGFP和pAdCCR7構(gòu)建成功。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdCCR7及對(duì)照腺病毒pAdGFP。 第三部分腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CTLA4Ig、CCR7基因修飾樹突狀細(xì)胞 目的：從小鼠骨髓分離單個(gè)核細(xì)胞，建立體外原代培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞的方法，確定影響樹突狀細(xì)胞成熟的因素和CTLA4Ig、CCR7表達(dá)效率，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CTLA4Ig和CCR7基因的樹突狀細(xì)胞疫苗。

7、 方法：從小鼠脛骨和股骨沖洗出骨髓，制成細(xì)胞懸液，在GM-CSF和IL-4作用下，體外培養(yǎng)7天。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表型，確定為樹突狀細(xì)胞后，感染重組腺病毒并與OVA共同孵育。FACS鑒定細(xì)胞成熟狀態(tài)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，F(xiàn)ACS和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)CTLA4Ig和CCR7兩種蛋白的表達(dá)及共表達(dá)情況。 結(jié)果：50％左右細(xì)胞具有CD11c表

8、型，確定為樹突狀細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AdCTLA4Ig和.AdCCR7共感染的DC蛋白表達(dá)情況，約10.86％細(xì)胞表達(dá)CTLA4Ig，56.99％表達(dá)CCR7，10.04％為兩種蛋白的共同表達(dá)。激光共聚焦技術(shù)不僅可以觀測(cè)到胞膜胞漿還可觀測(cè)到胞核蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，約80％以上細(xì)胞表達(dá)CTLA4Ig，90％以上表達(dá)CCR7，75％以上為兩種蛋白的共表達(dá)，而對(duì)照組AdGFP則無表達(dá)或低表達(dá).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)AdCTLA4Ig和Ad

9、CCR7共感染的DC表型CD40、CD80和CD86表達(dá)均有所降低，尤其是CD80和CD86下降明顯。 結(jié)論：腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CTLA4Ig和CCR7修飾DCs可使DCs同時(shí)表達(dá)兩種蛋白分子，而共刺激分子CD40/CD80/CD86表達(dá)減少。 第四部分重組CTLA4Ig和CCR7誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞治療哮喘的研究 目的：通過尾靜脈回輸AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs，觀察其對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和Th失衡的干

10、預(yù)作用以及免疫耐受反應(yīng)是否局限于局部肺組織。 方法：SPF級(jí)BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、AdGFP-DC對(duì)照組和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC干預(yù)組。哮喘模型組用OVA致敏和激發(fā)；正常對(duì)照組用生理鹽水代替；AdGFP-DC對(duì)照組和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC干預(yù)組激發(fā)前2個(gè)小時(shí)分別回輸AdGFP-DC和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC，余處理同模型組。觀察哮喘的發(fā)作情況：肺組織

11、病理切片檢測(cè)肺部病理損害，支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類，ELISA檢測(cè)BALF和血清中Th1、Th2類細(xì)胞因子，免疫熒光法檢測(cè)肺、腎、小腸組織CCR7蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：與AdGFP-Dc組小鼠比較，AdCTLA4Ig/AdCCRT-DCs尾靜脈回輸可明顯減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀；減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；減輕肺部病理損害，降低氣道局部Th1、Th2類細(xì)胞因子，但對(duì)血清中細(xì)胞因子則無明顯調(diào)節(jié)作用。尾靜