CTLA4Ig修飾樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)氧化修飾低密度脂蛋白免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分CTLA4Ig誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)氧化修飾低密度脂蛋白免疫無能的研究 目的：目前研究認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，免疫應(yīng)答是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要因素。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)、T淋巴細(xì)胞和氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized-low density lipoprotein，OX-LDL)均參與了致動(dòng)脈粥樣硬化的免疫反應(yīng)。本研究擬采用融合蛋白CTLA4Ig阻斷DC上B7與T細(xì)胞上CD28結(jié)合而傳遞

2、的共刺激信號(hào)，誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)ox-LDL的免疫無能，并對(duì)機(jī)理進(jìn)行初步探討，以期發(fā)現(xiàn)防治動(dòng)脈粥樣硬化的新策略。 方法：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，黏附法分離單核細(xì)胞，加入rhGM-CSF(500IU/ml)和rhIL-4(500IU/ml)培養(yǎng)6天以誘導(dǎo)DC.在DC中分別加入PBS、LDL(10μg/ml)、ox-LDL(10μg/ml)和LPS(30 ng/ml)，作用48小時(shí)，流式細(xì)胞法檢測CD86、HLA-DR等細(xì)胞標(biāo)志。ELISA

3、法檢測上清中IL-12的含量。取刺激后的DC與同種異體T淋巴細(xì)胞行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocytereaction，MLR)，ox-LDL組分別加入不同濃度的CTLA4Ig(0、0.31、0.62、1.25μg/ml)，MTT法檢測T細(xì)胞的增殖。分別以流式細(xì)胞法和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISpot)法檢測MLR中T細(xì)胞CD25的表達(dá)、T細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞因子分泌情況。 結(jié)果：1、LPS和ox-LDL可以促進(jìn)DC分泌IL

4、-12，較PBS和LDL有顯著性差異.CD86(B7)熒光表達(dá)率在LPS和ox-LDL10μg/ml刺激后較對(duì)照組(PBS組)均有明顯升高(P＜0.05)。HLA-DR(MHC-Ⅱ)的表達(dá)中也有相同的表現(xiàn)。CD86和HLA-DR的MFI在oxLDL(10μg/ml)刺激后明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。 2、ox-LDL負(fù)載的DC可明顯刺激MLR中的T細(xì)胞增殖，SI與PBS組和LDL組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。3、o

5、x-LDL能促進(jìn)MLR中T細(xì)胞分泌IL-2和IFNγ,(Th1樣細(xì)胞因子)，較PBS組和LDL組明顯升高(P＜0.05)。ox-LDL也能促進(jìn)MLR中T細(xì)胞分泌IL-4(Th2樣細(xì)胞因子)，較PBS組和LDL組明顯升高(P＜0.05)。4、CTLA4-Ig可抑制ox-LDL激發(fā)的同種異體MLR中T細(xì)胞增殖反應(yīng)，與未應(yīng)用CTLA4Ig組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。5、CTLA4-Ig可明顯抑制ox-LDL激發(fā)的同種異體

6、MLR中T細(xì)胞CD25的陽性率，與未應(yīng)用CTLA4Ig組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。6、應(yīng)用CTLA4Ig后，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的凋亡，與未用CTLA4Ig比較有顯著性差異(P＜0.01)。7、CTLA4Ig減少IL-2和IFNγ的ELISpot斑點(diǎn)數(shù)，較未應(yīng)用組有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)；CTLA4Ig增加IL-4的斑點(diǎn)數(shù)，較未應(yīng)用組有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論：1、ox-LDL可以促進(jìn)DC

7、的表型成熟，激發(fā)MLR，證明ox-LDL是一種抗原物質(zhì)；2、ox-LDL負(fù)載的DC激發(fā)的MLR中既有Th1型免疫應(yīng)答，也有Th2型免疫應(yīng)答；3、CTLA4Ig可以在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)ox-LDL的免疫無能；4、CTLA4Ig可以促進(jìn)ox-LDL負(fù)載的DC激發(fā)的MLR中的Th1/Th2偏移；5、CTLA4Ig可以抑制ox-LDL負(fù)載的DC激發(fā)的MLR中的T細(xì)胞活化；6、CTLA4Ig可以促進(jìn)ox-LDL負(fù)載的DC激發(fā)的MLR中的T細(xì)胞凋亡。

8、 第二部分CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染對(duì)樹突狀細(xì)胞針對(duì)氧化修飾低密度脂蛋白免疫功能的影響 目的：目前研究認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，DC與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的病理過程密切相關(guān)，干預(yù)DC功能可能成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要措施。CTLA4Ig可與抗原遞呈細(xì)胞的B7-1/2分子結(jié)合，阻斷抗原遞呈細(xì)胞和抗原特異性T淋巴細(xì)胞之間的共刺激信號(hào)傳遞。CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC在移植實(shí)驗(yàn)中可以誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)移植物抗原的免疫耐受。本研究

9、擬采用人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC為研究對(duì)象，研究含CTLA4Ig基因腺病毒(Ad-CTLA4Ig)轉(zhuǎn)染DC對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)抗原-ox-LDL免疫反應(yīng)的影響，以期在體外誘導(dǎo)對(duì)OX-LDL的免疫耐受，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 方法：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，黏附法分離單核細(xì)胞，加入rhGM-CSF(500IU/ml)和rhIL-4(500IU/ml)培養(yǎng)4天，用Ad-CTLA4Ig分別以感染指數(shù)(multiplicity of

10、infection，MOI)=100，MOI=200和MOI=300感染DC，以含強(qiáng)化綠色熒光蛋白(Ad-EGFP)轉(zhuǎn)染DC和未轉(zhuǎn)染的DC為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)4天。ELISA法檢測上清CTLA4Ig的含量。熒光顯微鏡、流式細(xì)胞法和免疫印跡(Western blot)法檢測CTLA4Ig的表達(dá)情況。取轉(zhuǎn)染3天后的DC，加入ox-LDL(10ug/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。ELISA法檢測上清IL-12含量。流式細(xì)胞法檢測CD86和HLA-DR

11、的表達(dá)率。取ox-LDL刺激48hr的基因轉(zhuǎn)染DC、未轉(zhuǎn)染DC及加入10ug/mlCTLA4Ig的未轉(zhuǎn)染DC，與同種異體淋巴細(xì)胞行MLR，MTT法檢測T細(xì)胞的增殖。分別以流式細(xì)胞法和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISpot)法檢測MLR中T細(xì)胞CD25的表達(dá)、T細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞因子分泌情況。 結(jié)果：1、CTLA4Ig表達(dá)率隨著時(shí)間逐漸增高，在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)達(dá)到高峰。MOI=200時(shí)轉(zhuǎn)染率最高。2、CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC經(jīng)ox-LDL刺激

12、后，IL-12的分泌量明顯低于Ad-EGFP轉(zhuǎn)染DC(P＜0.05)和未轉(zhuǎn)染DC(P＜0.05)。3、CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC CD86和HLA-DR的表達(dá)率明顯降低，以CD86的降低明顯(P＜0.05)。4、CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC在MLR中的SI均明顯低于未轉(zhuǎn)染DC和Ad-EGFP轉(zhuǎn)染DC(分別P＜0.05)。5、在ox-LDL負(fù)載的CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC激發(fā)的MLR中，CD25的表達(dá)率較未轉(zhuǎn)染DC和Ad-EGFP轉(zhuǎn)染DC明

13、顯降低(P＜0.05)。6、在ox-LDL負(fù)載的CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC激發(fā)的MLR中，T細(xì)胞凋亡率較未轉(zhuǎn)染DC和Ad-EGFP轉(zhuǎn)染DC明顯增高(P＜0.01)。7、在CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DC激發(fā)的MLR中，T細(xì)胞分泌的IL-2和IFNγ,較空白對(duì)照和Ad-EGFP轉(zhuǎn)染DC明顯降低(均P＜0.05)。T細(xì)胞分泌的IL-4較空白對(duì)照和Ad-EGFP轉(zhuǎn)染DC明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論：1、Ad-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染人DC的最佳MOI=