負(fù)載自身抗原的未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)狼瘡鼠免疫耐受的研究.pdf

1、目的：探討負(fù)載自身抗原的未成熟樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)外誘導(dǎo)免疫耐受的作用，為探索新的主動(dòng)免疫方法防治SLE提供依據(jù)。 方法： 1.imDC提取和培養(yǎng)：無菌提取小鼠股骨骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)和數(shù)量的變化。標(biāo)定單克隆抗體，經(jīng)熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞(流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠DCs的特異性表面標(biāo)志33D1，鑒定細(xì)胞，及確定DCs純度)。破裂部分經(jīng)BrdU標(biāo)記的DCs作為自身抗原，并與其余DCs共同孵育，采用

2、免疫組化、透射電鏡驗(yàn)證imDC吞噬自身抗原成分。 2.imDC體外誘導(dǎo)免疫耐受：采用流式細(xì)胞儀，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)及ELISA法探討負(fù)載自身抗原的imDC體外誘導(dǎo)免疫耐受的作用。 3.狼瘡鼠模型的建立：選取4～6周SPF級(jí)Balb/c小鼠，分3組(剪腳趾區(qū)分)，每組10只小鼠均為同基因背景。V1組注射提取的同系Balb/c小鼠核蛋白，采用肌肉注射法，間隔3周免疫1次，共免疫4次；V2組注射等體積PBS；V3組正常對(duì)照組。通

3、過檢測(cè)小鼠24h尿蛋白、血清ANA、抗ds-DNA抗體、小鼠腎臟直接免疫熒光，分析建模成功率。 4.負(fù)載自身抗原的imDC免疫狼瘡鼠模型：選取4～6周SPF級(jí)Balb/c小鼠，每組10只為同基因背景小鼠。S1組注射提取的同系Balb/c小鼠核蛋白；S2組每次免疫前1周經(jīng)小鼠尾靜脈輸入同基因背景Balb/c小鼠骨髓來源負(fù)載自身抗原后的imDCs；S3組注射等體積PBS；S4組正常對(duì)照組。通過檢測(cè)小鼠24h尿蛋白、血清ANA、抗ds

4、-DNA抗體、小鼠腎臟直接免疫熒光，分析負(fù)載自身抗原的imDC體內(nèi)誘導(dǎo)同基因狼瘡鼠免疫耐受的作用。 結(jié)果： 1.在圈定的細(xì)胞中，33D1陽性的細(xì)胞占90.6％，即所培養(yǎng)的DCs的純度達(dá)到90.6％。 2.應(yīng)用免疫組化，透射電鏡法證明imDC胞漿中出現(xiàn)棕黃色碎片，胞核仍藍(lán)染。 3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs的表面標(biāo)記，DCs0表達(dá)MHCII(46.53±3.66)％,CD86(39.17±3.23)％；DCs

5、1表達(dá)MHCII(31.53±4.07)％,CD86(20.07±1.60)％。DCs1表達(dá)MHC II和CD86均比DCs0低，表達(dá)MHC II的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表達(dá)CD86的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。應(yīng)用MTT法測(cè)定DCs1對(duì)同基因背景Balb/c小鼠脾淋巴細(xì)胞的抑制率高于DCs0，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌情況，DCs1分泌IL-4的量高于DCs0，且差異有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義(P<0.01)；分泌IFN-γ的量低于DCs0，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.V1組小鼠24h尿蛋白為(702.10±3.81) mg/ml，明顯高于V2組的(40.50±0.97) mg/ml和V3組的(38.50±3.21) mg/ml，V1組與其他兩組均有差異，而V2組與V3組無差異(F=170391.37，P=0.000)；V1組小鼠抗ds-DNA抗體為(50.52±0.74) pg/ml，明顯高于V

7、2組的(8.60±0.63)pg/ml和V3組的(8.43±1.30) pg/ml，V1組與其他兩組均有差異，而V2組與V3組無差異(F=6719.201，P=0.000)；V1組小鼠ANA為(22.92±1.73)ng/ml，明顯高于V2組的(7.88±1.08) ng/ml和V3組的(8.19±0.84) ng/ml，V1組與其他兩組均有差異，而V2組與V3組無差異(F=457.452，P=0.000)；V1組小鼠腎小球有IgG、I

8、gM免疫復(fù)合物沉積，可見腎小球輪廓，V2組、V3組未見腎小球輪廓，只見非特異性的微弱熒光。 5.S1組小鼠24 h尿蛋白為(875.10±9.04) mg/ml，高于S2組小鼠的(368.50±7.00) mg/ml，明顯高于S3組小鼠的(51.40±5.58) mg/ml和S4組小鼠的(49.30±4.60) mg/ml，S3組與S4組無差異，S1組與S2組有差異，且與S3組，S4兩組均有差異(F=33164.524，P=0.

9、000)；S1組小鼠抗ds-DNA抗體為(55.52±3.04) pg/ml，高于S2組小鼠的(27.90±4.35)pg/ml，明顯高于S3組小鼠的(9.58±1.94)pg/ml和S4組小鼠的(8.92±3.31)pg/ml，S3組與S4組無差異，S1組與S2組有差異，且與S3組，S4兩組均有差異(F=445,93，P=0.000)；S1組小鼠ANA為(23.37±1.57)ng/ml，高于S2組小鼠的(17.24±1.39)ng/

10、ml，明顯高于S3組小鼠的(8.18±1.27) ng/ml和S4組小鼠的(8.16±1.39) ng/ml，S3組與S4組無差異，S1組與S2組有差異，且與S3組、S4組均有差異(F=278.619，P=0.000)。S2組小鼠較S1組小鼠CD4+脾淋巴細(xì)胞升高，CD8+脾淋巴細(xì)胞降低，CD4+CD25+細(xì)胞升高；較S3組、S4組小鼠CD4+脾淋巴細(xì)胞降低，CD8+脾淋巴細(xì)胞升高，CD4+CD25+細(xì)胞升高。S1組小鼠腎小球有IgG、

11、IgM免疫復(fù)合物沉積，可見腎小球輪廓；S2組小鼠腎小球可見腎小球微弱熒光；S3組、S4組小鼠未見腎小球輪廓，只見非特異性的微弱熒光。 結(jié)論： 1.imDC能夠吞噬自身抗原，吞噬自身抗原會(huì)抑制DCs進(jìn)一步發(fā)育成熟，使DCs維持未成熟狀態(tài)，并且介導(dǎo)對(duì)自身抗原的免疫耐受。 2.通過提取同基因背景Balb/c小鼠核蛋白作為抗原，能夠在近交Balb/c小鼠上成功誘導(dǎo)SLE動(dòng)物模型，其病理狀態(tài)與人類SLE相似。 3.