CCR7聯(lián)合Rel-B基因?qū)π∈笪闯墒鞓?shù)突細(xì)胞免疫原性和遷移功能的影響.pdf

1、研究背景及研究目的：
　　燒傷是平時(shí)生活和戰(zhàn)爭(zhēng)中比較常見(jiàn)的疾病,淺度燒傷可以經(jīng)過(guò)藥物治療后自愈,然而治愈深度燒傷最好的辦法是皮膚移植?，F(xiàn)在治愈大面積深度燒傷中皮膚移植是常用的方法,皮膚移植往往是自體皮膚移植,但自體皮膚移植往往存在的一個(gè)缺點(diǎn)就是自身可供移植的皮膚不夠,不能完全覆蓋創(chuàng)面,影響到治療效果?？茖W(xué)家們?cè)?jīng)嘗試用過(guò)同種異體皮膚移植來(lái)解決皮膚移植中供皮來(lái)源不足的問(wèn)題,但同種異體皮膚往往伴激活免疫應(yīng)答,免疫應(yīng)答和免疫排斥導(dǎo)致皮膚

2、移植的失敗,為了解決這個(gè)問(wèn)題,科學(xué)家們一直探索免疫耐受的機(jī)制,包括免疫細(xì)胞的特性,特別是抗原提呈細(xì)胞(APC)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是一種功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,DC能夠攜帶抗原信息,從外周器官遷移到淋巴組織的T淋巴細(xì)胞區(qū),將抗原提呈給T淋巴細(xì)胞,激活活化初始T淋巴細(xì)。同時(shí),DC可以通過(guò)誘導(dǎo)形成調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞,細(xì)胞克隆刪除和刪除記憶性T細(xì)胞,在形成免疫耐受和免疫排斥中起著重要作用[1,2]。這就使DC作為一種治

3、療方法在移植中探索應(yīng)用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,輸入捐助者或接收者來(lái)源的耐受性DC,可以更廣泛地延長(zhǎng)移植物的存活。在臨床實(shí)驗(yàn)中,DC在移植中也開(kāi)始應(yīng)用,但仍存在很多問(wèn)題需要解決,包括細(xì)胞的分離和純化技術(shù),細(xì)胞的來(lái)源和途徑,以及如何靶向性的誘導(dǎo)免疫耐受等[3]。
　　未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cell,imDC)有著較高的抗原遞呈能力以及較低的共刺激分子,能夠誘導(dǎo)低免疫應(yīng)答和產(chǎn)生免疫耐受,所以imDC成為了現(xiàn)在誘

4、導(dǎo)免疫耐受研究的重點(diǎn),這已經(jīng)在我們以前國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30271341)中得到證明。而我們?cè)趪?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30672173)也證實(shí)imDC轉(zhuǎn)染CCR7后具有較高的遷移能力,將轉(zhuǎn)染CCR7基因的imDC輸入同種異體皮膚移植小鼠中后,其皮膚存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于輸入mDC組以及輸入PBS組。因?yàn)閕mDC能夠誘導(dǎo)免疫耐受,但具有較低的CCR7,所以在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30672173)中,我們?cè)噲D通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染C

5、CR7基因使供者源imDC的CCR7表達(dá)上升,增強(qiáng)imDCs的遷移及免疫耐受能力,但腺病毒轉(zhuǎn)染imDC也會(huì)部分促使imDC向mDC分化,使共刺激分子升高,共刺激分子通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合,可為T(mén)細(xì)胞激活提供第二信號(hào),再通過(guò)引發(fā)T細(xì)胞分化和相關(guān)細(xì)胞因子分泌等,對(duì)機(jī)體免疫起著正性作用,影響了誘導(dǎo)免疫耐受功能的發(fā)揮。如何使CCR7基因轉(zhuǎn)染imDC后能夠上升CCR7基因表達(dá)同時(shí)抑制共刺激分子的表達(dá)呢?現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn),RelB基因能夠調(diào)節(jié)共刺激分子的表

6、達(dá),下調(diào)RelB基因,能夠下調(diào)共刺激分子。為更好的發(fā)揮供者源imDC的作用,我們嘗試同時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)CCR7基因和下調(diào)RelB基因,使imDC有著較高遷移性的同時(shí)表達(dá)較低共刺激分子,更好的誘導(dǎo)形成免疫耐受,從而為延長(zhǎng)同種異體皮膚的存活時(shí)間提供一個(gè)新的思路和方法。
　　研究方法：
　　1、小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)及功能鑒定
　　在體外,GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞成為樹(shù)突狀細(xì)胞,第5天的細(xì)胞為

7、imDC,而在7天時(shí)加入LPS刺激,形成mDC,通過(guò)光鏡、電鏡來(lái)觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀和蛋白電泳檢測(cè)特異性標(biāo)志分子和共刺激分子的表達(dá)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)imDC和mDC功能的變化。
　　2、小鼠趨化因子CCR7重組慢病毒感染對(duì)DC2.4細(xì)胞免疫原性和遷移功能的影響
　　分別構(gòu)建空載慢病毒和帶有CCR7上升基因的慢病毒,并且?guī)в芯G色熒光蛋白,培養(yǎng)小鼠未成熟細(xì)胞細(xì)胞系DC2.4,用慢病毒感染DC2.4,分為三

8、組,正常DC2.4組叫做DC2.4組,空載慢病毒感染DC2.4組叫做GFP-DC2.4,帶有CCR7上升基因慢病毒感染DC2,4組,叫做CCR7-DC2.4。光鏡和熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀,蛋白印跡法分別檢測(cè)感染前后共刺激分子CD80和CD86的變化,激光共聚焦檢測(cè)CCR7分子的變化,體外趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外趨化能力的改變。
　　3、上調(diào)小鼠CCR7聯(lián)合下調(diào)Rel-B基因?qū)ξ闯墒鞓?shù)突細(xì)胞免疫原性和遷移功能的影響
　　

9、設(shè)計(jì)RelBSiRNA,用CCR7腺病毒和Rel-BSiRNA同時(shí)轉(zhuǎn)染imDC,用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR7的變化,趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移功能的變化。加入LPS刺激使imDC變?yōu)閙DC,蛋白電泳檢測(cè)Rel-B的蛋白表達(dá)變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)共刺激分子CD80和CD86的變化,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)免疫原性的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)及功能鑒定
　　1.

10、1、小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)光鏡觀察情況
　　培養(yǎng)的第3天可見(jiàn)有樹(shù)突狀突起的細(xì)胞,形態(tài)上體積比較小,比較圓潤(rùn),疏松貼壁并聚集成團(tuán)呈集落樣生長(zhǎng)。至第5天突起逐漸增多,細(xì)胞團(tuán)也逐漸增多,細(xì)胞體積增大,表面毛刺狀突起明顯,但仍然疏松貼壁生長(zhǎng),加入LPS刺激后可見(jiàn)細(xì)胞表面伸出比較明顯的樹(shù)突狀樣結(jié)構(gòu),長(zhǎng)短大小不一,懸浮細(xì)胞數(shù)目增多和體積增大,突起明顯增多增大。
　　1.2、小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞掃描電鏡觀察結(jié)果
　　從掃描電

11、鏡結(jié)果可見(jiàn):imDC表面較光滑,但表面凹凸不平,毛刺狀突起幾乎沒(méi)有。mDC表面不光滑,并且伸出許多樹(shù)枝樣突起,長(zhǎng)短不一,形態(tài)各異,比較符合成熟DCs的典型細(xì)胞形態(tài),為下一步功能實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　1.3、小鼠骨髓源樹(shù)突細(xì)胞按照上述方法分離,經(jīng)IL-4、GM-CSF作用后,于第5天加入LPS刺激其向成熟轉(zhuǎn)變,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD11C,CD80,CD86,MHCⅡ的表達(dá)。在imDC中CD11c、CD80、CD86、MHC

12、Ⅱ的陽(yáng)性率分別低于在mDC的表達(dá)率,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示,imDC和mDC的CD11C、CD80、CD86、MHCⅡ差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01),這符合imDC低表達(dá)而mDC高表達(dá)表面分子的表型特征。
　　1.4、從蛋白電泳圖上可以看出,成熟樹(shù)突細(xì)胞的CD80、CD86表達(dá)明顯高于未成熟樹(shù)突細(xì)胞的蛋白表達(dá)。imDC的CD80蛋白表達(dá)量為(0.65±0.1),而mDC的蛋白表達(dá)量為(1.36±0.1),為imDC的2倍,存在明顯差異(P

13、<0.01)。imDC的CD80蛋白表達(dá)量為(0.54±0.1),而mDC的蛋白表達(dá)量為(1.47±0.08),為imDC的2.7倍,存在明顯差異(P<0.01)。說(shuō)明imDC受到刺激后,共刺激分子CD80和CD86會(huì)明顯上升,為以后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　1.5、通過(guò)單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)來(lái)評(píng)價(jià)培養(yǎng)的imDC對(duì)同種異體未致敏T淋巴細(xì)胞的刺激能力,imDC刺激T細(xì)胞后OD值為:(1.33±0.31),mDC刺激T細(xì)胞后

14、OD值為:(2.38±0.4),對(duì)T細(xì)胞的刺激能力是imDC的1.79倍,存在明顯差異(P<0.01)。
　　1.6、通過(guò)ELISA結(jié)果顯示,imDC分泌IL-2和IFN-γ量分別為(2848.37±162.67)pg/ml和(156.25±27.09)pg/ml,mDC分泌IL-2和IFN-γ量分別為(3610.36±106.59)pg/ml和(287.33±14.85)pg/ml,成熟樹(shù)突細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ量明顯高于

15、未成熟樹(shù)突細(xì)胞(P<0.01)。imDC分泌IL-4和IL-10量分別為:(186.56±6.6)pg/ml和(147.40±23.23)pg/ml,mDC分泌IL-4和IL-10為(106.5±5.3)pg/ml和(77.91±10.88),imDC分泌IL-4量明顯高于mDC(p<0.01)。從以上結(jié)果可以看出,mDC刺激T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ明顯高于imDC(p<0.01),而imDC刺激T細(xì)胞分泌的IL-10和

16、IL-4明顯高于mDC(p<0.01)。
　　2、小鼠趨化因子CCR7重組慢病毒感染對(duì)DC2.4細(xì)胞免疫原性和遷移功能的影響
　　2.1、光鏡下觀察DC2.4細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),集落式生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)呈圓形,慢病毒感染后細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯改變。24h后熒光顯微鏡下觀察,就可以發(fā)現(xiàn)明亮的GFP表達(dá),此后逐漸增強(qiáng),并且在96小時(shí)達(dá)到熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰,陽(yáng)性率可以達(dá)到87.4％。
　　2.2、經(jīng)過(guò)流式上機(jī)檢測(cè)后,3組細(xì)胞CD80、CD

17、86、MHCⅡ的表達(dá)陽(yáng)性率分別為無(wú)明顯差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果P值均大于0.05。
　　2.3、蛋白印記結(jié)果
　　蛋白印記結(jié)果顯示,CCR7-DC2.4組CCR7蛋白表達(dá)量(45.1±2.1)明顯高于DC2.4(25.32±1.4)和GFP-DC2.4(28.6±0.9)(P<0.01)。DC2.4、GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4的CD80表達(dá)量分別為33.9±2.2、33.2±1.6、32.9±1.8,三組無(wú)明顯差別(P>

18、0.05)。DC2.4、GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4的CD86表達(dá)量分別為39.9±1.3、33.1±2.1、33.9±2.3,三組無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　2.4、細(xì)胞免疫熒光結(jié)果
　　細(xì)胞免疫熒光顯示DC2.4細(xì)胞表達(dá)很低的CCR7,GFP-DC2.4細(xì)胞可表達(dá)少量CCR7,CCR7-DC2.4細(xì)胞CCR7的表達(dá)增加,說(shuō)明慢病毒載有CCR7基因能夠有效的轉(zhuǎn)入DC2.4并表達(dá)CCR7蛋白。
　　2

19、.5、體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　體外遷移實(shí)驗(yàn)表明,CCR7-DC2.4在CCL19作用下體外趨化遷移率(35.33±5.4)%明顯高于DC2.4(5.5±0.6)%和GFP-DC2.4(6.34±0.6)%(P<0.01)。說(shuō)明載有CCR7的慢病毒轉(zhuǎn)染DC2.4后,使其遷移功能明顯上升。
　　3、上調(diào)CCR7聯(lián)合下調(diào)Rel-B基因?qū)π∈笪闯墒鞓?shù)突細(xì)胞免疫原性和遷移功能的影響
　　3.1、培養(yǎng)的imDC和mDC形態(tài)同第一部分

20、描述,用熒光顯微鏡觀察,均能看到腺病毒感染的綠色熒光和SiRNA感染的紅色熒光。說(shuō)明腺病毒和SiRNA能夠有效的轉(zhuǎn)染DC。
　　3.2、用LPS刺激后,提取蛋白,檢測(cè)Rel-B,從蛋白電泳結(jié)果中可以看出,共轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒和RelBSiRNA的DC表達(dá)較低Rel-B蛋白,明顯低于mDC。
　　3.3、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后第一天,imDC在轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后,CCR7陽(yáng)性率表達(dá)明顯上升,明顯高

21、于imDC組。在經(jīng)過(guò)LPS刺激后。imDC在轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后即使經(jīng)過(guò)LPS刺激,其共刺激分子CD80和CD86陽(yáng)性率低于mDC(P<0.01),說(shuō)明共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA能夠在LPS刺激時(shí)仍然保持較低的共刺激分子表達(dá)。
　　3.4、體外趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　在共轉(zhuǎn)染后,用體外趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移率,結(jié)果如下,imDC:(3.92+0.23)%,imDC+空Ad:(10.60

22、+0.83)%,imDC+空SiRNA:(9.13+0.42)%,imDC+空Ad+空SiRNA:(17.50+1.0)%,imDC+Ad-CCR7:(33.83+2.47)%,imDC+Rel-BsiRNA:(3.47+0.38)%,imDC+Ad-CCR7+Rel-BsiRNA:(32.35+1.59)%,mdc:(29.38+1.02)%imDC在共轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后其遷移效率明顯高于imDC(P<0.01