SW-HSA的合成及其對小鼠免疫原性的研究.pdf

1、瘋草是世界范圍內危害草原畜牧業(yè)生產最為嚴重的一類毒草，廣泛分布于我國西部和美國、俄羅斯、澳大利亞、加拿大等國家，給畜牧業(yè)生產造成巨大損失。因為瘋草的粗蛋白含量與苜蓿相當，具有著作為優(yōu)良飼草的潛力。為防治瘋草中毒和綜合利用瘋草，學者們從不同思路和角度出發(fā)進行研究。瘋草的主要有毒成分是苦馬豆素(swainsoninc，SW)，從免疫學角度講，SW可以作為半抗原，與大分子載體蛋白偶聯(lián)，化學合成為人工抗原，并制成疫苗，誘導機體產生特異性抗體，使

2、動物獲得免疫力并在采食瘋草時得到保護。本論文的目的在于將SW與大分子蛋白(HSA)偶聯(lián)得到不同結合率SW-HSA，并制成疫苗接種小鼠，以研究不同結合率疫苗對小鼠的免疫原性，探討哪一種結合率的疫苗產生的免疫原性好，為以后建立單鏈抗體(ScFv)庫奠定基礎。論文系統(tǒng)地研究了苦馬豆素(半抗原)純品的制備，進行了4種不同結合率SW-HSA的合成及其免疫原性研究。結果如下： 1 變異黃芪中苦馬豆素的分離、鑒定本試驗是為苦馬豆素免疫原合成提

3、供原料。以變異黃芪干草粉為材料，用工業(yè)酒精熱回流提取后減壓回收溶劑，浸膏用1 mol/L HCl酸化，氯仿萃取除去雜質，水液部分用固體NaOH或濃NH<,3>·H<,2>O調pH至9-10，再用正丁醇萃取6-7次，回收正丁醇得到總生物堿，將總生物堿硅膠拌樣，硅膠柱層析，洗脫劑洗脫，TLC檢測，同類合并，揮干后再經氨性氯仿處理。將氨性氯仿部分干燥后100℃油浴減壓升華得到白色針狀結晶，經TLC、MP、IR、MS分析鑒定為苦馬豆素。

4、 2 苦馬豆素-HSA的合成研究將SW與活性酯在70℃條件下反應制備季銨鹽，然后將季銨鹽與HSA冰浴攪拌反應12 h，通過調節(jié)季銨鹽與HSA的摩爾比制備SW-HSA，透析并冷凍干燥，采用紫外分光光度法測定SW-HSA偶聯(lián)率。得到偶聯(lián)率分別為18.6、12.5、13.5和32.6的SW-HSA。 3 苦馬豆素-HSA的免疫原性研究將20只昆系小白鼠隨機分為A、B、C、D和E組，每組4只，分別編號為A1～A4、B1～B4、C1～C4

5、、D1～D4和E1～E4。用4種不同偶聯(lián)率的SW-HSA對前4組小鼠進行免疫，E組空白對照。首次免疫時，在小鼠頸部兩側、背部及后腿內側分5點皮下注射福氏完全佐劑乳化制備的抗原液；抗原量為0.050mg/只，第30 d進行第2次免疫，福氏不完全佐劑乳化制備抗原液，抗原量與首免相同，以后每隔20 d進行1次，抗原量均為前一次免疫所用抗原量的1.5倍，注射用生理鹽水溶解后免疫小鼠，前5次免疫途徑與首免相同，第6次免疫途徑為背部皮下和腹腔內注射

6、，第7次免疫途徑為腹腔內注射，共免疫7次。E組注射等量生理鹽水。從第3次免疫后ELISA檢測血清中抗SW抗體效價。ELISA測定結果顯示，從第3次免疫后，A、B、C、D組試驗小鼠均產生抗SW抗體，并且抗體效價呈上升趨勢，在第5次免疫后，測得A、B、C、D組試驗小鼠抗SW抗體效價分別為2<'8>、2<'9>、2<'9>、2<'9>，達到最高峰。其中D組的抗SW抗體效價在第4次免疫后首先達到2<'9>，并在第5次免疫后維持在相同水平。各組試