草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白的免疫原性研究.pdf

1、草魚自古以來就是中國當(dāng)家品種,但是長期以來備受病害的侵襲,讓養(yǎng)殖場等遭受很大的經(jīng)濟(jì)損失,由草魚呼腸孤病毒引起的草魚出血病尤為突出。引起草魚出血病的是草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV),可導(dǎo)致草魚魚種發(fā)生階段性出血病,死亡率高達(dá)90％以上,還能感染青魚、麥穗魚和稀有鮈鯽等。當(dāng)前尚無有效對抗出血病毒的藥物,因此對該病毒的亞單位疫苗研究具有都十分重要的意義。
　　本文主要的研究主要分兩個方面:
　　

2、1、GCRV的外殼蛋白基因vp5、vp7的克隆和原核表達(dá),多克隆抗體的制備以及其病毒中和能力分析實驗
　　本實驗室在江西某草魚養(yǎng)殖場的患出血病病魚體上分離到一株具強(qiáng)致病力的病毒株(命名為GCRV-JX01,GenBank: JQ042807.1),根據(jù)GeneBank上草魚呼腸孤病毒外殼蛋白基因vp5和vp7的全基因組序列來設(shè)計引物,提取感染出血病毒草魚的RNA為模板,并對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,然后將其克隆到表達(dá)載體 pGEX-4T-

3、3質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化入Escherichia coli DH5α中,經(jīng)PCR刪選出陽性菌種并送生物公司測序確認(rèn)。所得陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析后,分別獲得大小分別為90kDa和52kDa的重組蛋白pGEX-4T-VP5和重組蛋白pGEX-4T-VP7。SDS-PAGE的結(jié)果顯示出兩種目的蛋白的存在形式均是包涵體。割膠回收并用小量蛋白回收試劑盒(生工)純化,將純化產(chǎn)物分別作為免疫原注射BALB/c小鼠,分別獲得抗VP5血清(a

4、nti-vp5)和抗 VP7血清(anti-vp7)的多克隆抗體,并采用體外微量中和實驗分析多克隆抗體血清anti-vp5和anti-vp7的中和能力。
　　Western blot分析顯示anti-vp5和anti-vp7均可以和誘導(dǎo)蛋白發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。微量中和實驗及病毒滴度實驗結(jié)果證明anti-vp5和anti-vp7多抗血清能夠特異性中和呼腸孤病毒粒子,并且能夠有效的阻止它的感染,其中VP7抗血清中和效價比VP5的抗血

5、清的中和效價高很多。這一結(jié)果為草魚呼腸孤病毒的免疫檢測方法的建立提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
　　2、基于GCRV外衣殼蛋白免疫原性的病毒血清學(xué)診斷技術(shù)研究實驗
　　頻繁爆發(fā)的草魚出血病給草魚養(yǎng)殖帶來很大的困擾,雖然基于核酸的各種診斷方法有被證明是有效的,但是由于缺乏草魚 IgM的單克隆抗體所以沒有可靠并商業(yè)化的免疫學(xué)檢測GCRV感染的方法。所以本文介紹了制備抗草魚IgM恒定區(qū)的單克隆抗體的方法,及開發(fā)了基于GCRV的外衣殼蛋白VP7作

6、為抗原的免疫學(xué)的檢測方法檢測GCRV的感染。本文根據(jù)草魚免疫球蛋白IgM的序列,設(shè)計草魚IgM重鏈的恒定區(qū)CH1和CH2的表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增片段克隆至表達(dá)載體pET-16B-1,采用PCR刪選陽性菌株并送測序確認(rèn)。將陽性菌株在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后,獲得重組蛋白pET-16B-CH1和pET-16B-CH2,凝膠電泳分析結(jié)果顯示兩種蛋白都以包涵體形式存在。重組蛋白r

7、CH1和rCH2利用組氨酸蛋白純化樹脂進(jìn)行純化表達(dá)產(chǎn)生重組蛋白,并以純化重組蛋白rCH1和rCH2作為免疫原,分別免疫BALB/c小鼠獲得CH1和CH2的多抗血清,取實驗結(jié)果效價高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞融合,然后兩次篩選,再克隆后得到8株分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。通過ELISA及Western blot方法篩選出能穩(wěn)定分泌抗草魚IgM的單克隆抗體,分別命名2E8(抗CH1),3A2(抗CH2)。利用2E8和3A2兩株單克隆抗體

8、檢測抗草魚呼腸孤病毒的抗體來驗證獲得鼠抗的草魚 IgM的抗血清。經(jīng)免疫印跡檢測,表明兩株單克隆抗體都可以特異性的識別純化的草魚IgM;將純化后的GCRV病毒粒子和rVP7蛋白分別免疫草魚,并在免疫7、14、28、32天采集草魚血清。這些免疫后的草魚血清以及從江西南昌和廣東廣州采樣回來的病樣草魚血清都作為草魚血清樣本,運(yùn)用 ELISA、RT-PCR、Western blot、Dot-blot等方法將rVP7作為抗原進(jìn)行檢測,證實VP7蛋白

9、的免疫原性。
　　ELISA、RT-PCR、Western blot、Dot-blot等檢測方法檢測出來的結(jié)果基本一致,發(fā)現(xiàn)草魚血清通過單克隆抗體2E8和3A2都能特異性的識別草魚IgM中的抗VP7抗體。這些結(jié)果說明了所制備的單克隆抗體可以識別到草魚免疫應(yīng)答的病原體,也進(jìn)一步驗證了VP7具有很好的免疫原性,可以作為草魚呼腸孤病毒亞單位疫苗的有效組分。本文的研究為今后對草魚呼腸孤病毒的抗原檢測及應(yīng)用基于單克隆抗體檢測病毒的免疫學(xué)方法