免疫細(xì)胞遷移試驗(yàn)評(píng)價(jià)生物材料免疫原性的探索性研究.pdf

1、在大面積燒傷患者的皮膚移植過程中所需的自體皮源十分有限，而異體或異種皮移植又存在排異反應(yīng)。異基因組織工程皮膚因其具有來源廣泛，促進(jìn)再生等特點(diǎn)在燒傷治療中有良好的臨床應(yīng)用前景，已成為近年來創(chuàng)面修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一。然而如何克服免疫排斥反應(yīng)是異基因組織器官移植面臨的重大挑戰(zhàn)。組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的安全性問題一直受到國內(nèi)外食品藥品監(jiān)督局及衛(wèi)生管理機(jī)構(gòu)的重視，尤其是其產(chǎn)品用于人體之前的生物學(xué)評(píng)價(jià)。因此，從多個(gè)角度客觀評(píng)價(jià)其產(chǎn)品的免疫原性是醫(yī)用生物材料

2、研發(fā)的重大需求。本課題就從細(xì)胞遷移的角度分析評(píng)價(jià)組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的免疫原性。通過檢測細(xì)胞趨化活性，探索一種評(píng)價(jià)生物材料的免疫原性的實(shí)驗(yàn)方法，為評(píng)價(jià)研發(fā)的新型組織工程皮膚材料的免疫原性提供新方法及理論依據(jù)。
　　 目的
　　 1.通過兔血淋巴細(xì)胞的遷移試驗(yàn)，檢測刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞的劑量效應(yīng)，初步建立一種兔淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)評(píng)價(jià)生物材料免疫原性的實(shí)驗(yàn)方法。
　　 2.再次通過檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的遷移，并初步建立由細(xì)胞遷

3、移試驗(yàn)評(píng)價(jià)材料免疫原性的實(shí)驗(yàn)方法；
　　 3.基于本實(shí)驗(yàn)室前期探索的朗格漢斯細(xì)胞體外誘導(dǎo)方案，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察朗格漢斯細(xì)胞形態(tài)及CD196和CD86的表型鑒定，篩選出朗格漢斯細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳方案，預(yù)期為探索朗格漢斯細(xì)胞遷移試驗(yàn)提供效應(yīng)細(xì)胞。
　　 方法
　　 1.不同刺激劑作用下的兔淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)
　　 1.1取新西蘭大耳白兔(雌雄不限)靜脈血，采用密度梯度離心法分離出淋巴細(xì)胞，用PHA

4、和ConA分別作為淋巴細(xì)胞分泌趨化因子的刺激劑。在細(xì)胞懸液中，加入不同濃度的刺激劑，置37℃含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞上清。
　　 1.2將細(xì)胞上清作為趨化因子的來源，誘導(dǎo)兔淋巴細(xì)胞遷移，用Transwell法測定其細(xì)胞遷移率，比較各種刺激劑的遷移效果，了解不同刺激劑的淋巴細(xì)胞遷移效應(yīng)。
　　 2.不同刺激劑作用下的小鼠淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)
　　 2.1.取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾臟，采用研

5、磨法分離淋巴細(xì)胞，分別用PHA、ConA和CD3ε單克隆抗體作為淋巴細(xì)胞分泌趨化因子的刺激劑。在細(xì)胞懸液中，加入不同濃度刺激劑，置37℃含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞上清。
　　 2.2將細(xì)胞上清作為趨化因子的來源，誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞遷移，用Transwell法測定其細(xì)胞遷移率，比較各種刺激劑的遷移效果。了解其刺激劑的淋巴細(xì)胞遷移效應(yīng)。
　　 3.不同生物材料浸提液作用下的小鼠淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)
　　

6、 3.1制備生物材料浸提液：(1)可溶性材料，選取牛Ⅰ型膠原，將之溶解于純度>99.5%的乙酸溶液，小量分裝，保存于4℃。(2)不溶性材料，選取脫細(xì)胞凍干牛真皮，將其稱量后，按比例浸泡于RPMI-1640，孵育24小時(shí)，收集其浸提液，小量分裝保存于-20℃。
　　 3.2取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾臟，采用研磨法分離淋巴細(xì)胞，分別用生物材料浸提液作為淋巴細(xì)胞分泌趨化因子的刺激劑。在細(xì)胞懸液中，加入不同濃度材料浸提液，置37℃

7、含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞上清。
　　 3.3將細(xì)胞上清作為趨化因子的來源，誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞遷移，用Transwell法測定細(xì)胞遷移率，比較各種材料浸提液的遷移效果。了解其材料的淋巴細(xì)胞遷移效應(yīng)。
　　 4.小鼠淋巴細(xì)胞上清中趨化因子濃度水平的測定
　　 4.1取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾臟，采用研磨法分離淋巴細(xì)胞，分別用PHA、ConA和CD3ε單克隆抗體作為淋巴細(xì)胞分泌趨化因子的刺激劑

8、。在細(xì)胞懸液中，加入不同濃度刺激劑，置37℃含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞上清。
　　 4.2酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：在酶標(biāo)儀上檢測刺激劑作用小鼠淋巴細(xì)胞后的細(xì)胞上清中趨化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3、IL-16、IL-8及CCL20對(duì)應(yīng)的OD450值，計(jì)算出各趨化因子的濃度水平。
　　 5.朗格漢斯細(xì)胞的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
　　 5.1先用人淋巴細(xì)胞分離液得到臍血單個(gè)核細(xì)胞，以C

9、D34直接免疫磁珠法對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行直接標(biāo)記，分選和純化臍血單個(gè)核細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞。
　　 5.2以5種不同的細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)方案，對(duì)分選出的CD34+細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過掃描電鏡和透射電鏡觀察其細(xì)胞生長形態(tài)。
　　 5.3結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已有的表型鑒定的數(shù)據(jù)，再用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行CD196及CD86表型鑒定，篩選出最佳的LC體外誘導(dǎo)方案。
　　 結(jié)果
　　 1.兔淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)中，PHA

10、和ConA對(duì)應(yīng)的細(xì)胞遷移率，均和陰性對(duì)照有顯著差異。其中，PHA組的刺激濃度為5μg/ml時(shí)，其對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組；ConA組的刺激濃度為5、10μg/ml時(shí)，其對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組。
　　 2.小鼠淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)中，PHA組對(duì)應(yīng)的細(xì)胞遷移率和對(duì)照組無明顯差異；ConA和CD38對(duì)應(yīng)的細(xì)胞遷移率，均和陰性對(duì)照有顯著差異。其中，ConA組的刺激濃度為20μg/ml時(shí)，其對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)

11、照組；CD3ε組，其濃度分別為2.5和10μg/ml時(shí)，對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組。
　　 3.牛Ⅰ型膠原溶解液，其細(xì)胞遷移率和陰性對(duì)照有顯著差異。其中，當(dāng)濃度為5和10μg/ml時(shí)，對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞遷移率和對(duì)照組有明顯差異；當(dāng)其濃度分別為100、200和300μg/ml時(shí)，對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞遷移率和對(duì)照組有非常顯著的差異。
　　 4.脫細(xì)胞牛真皮浸提液，作用于淋巴細(xì)胞，其對(duì)應(yīng)的四個(gè)濃度的細(xì)胞遷移率和對(duì)照組均無明顯差異

12、。
　　 5.在各個(gè)刺激劑組中，ELISA測得的多種趨化因子水平在總體上存在明顯差異。趨化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3的水平明顯高于對(duì)照，說明這幾個(gè)因子在淋巴細(xì)胞遷移中起到重要的作用。趨化因子IL-16、IL-8及CCL20的水平和對(duì)照無明顯差異。
　　 6.通過掃描電鏡和透射電鏡的結(jié)果，結(jié)合已有的表型鑒定的數(shù)據(jù)，可知方案Ⅳ為最佳方案。
　　 結(jié)論
　　 1.兔淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)中，PHA和C

13、onA均能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移，其遷移率和對(duì)照組有顯著差異。
　　 2.小鼠淋巴細(xì)胞遷移試驗(yàn)中，PHA對(duì)淋巴細(xì)胞遷移無增強(qiáng)作用；ConA和CD3ε均能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移，其遷移率和對(duì)照組有顯著差異。
　　 3.PHA、ConA及CD3ε均誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌不同濃度水平的趨化因子。
　　 4.牛Ⅰ型膠原溶解液對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞遷移有增強(qiáng)作用，脫細(xì)胞牛真皮浸提液對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞遷移無增強(qiáng)作用。
　　 5.通過掃描電鏡及透射