組織工程皮膚種子細(xì)胞培養(yǎng)及免疫原性的初步研究.pdf

1、目的：本試驗(yàn)旨在探索一種能夠明顯縮短角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞接種密度和適合組織工程應(yīng)用的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基。通過(guò)檢測(cè)各代角質(zhì)形成細(xì)胞中朗格漢斯細(xì)胞(1angerhanscell，LC)、黑色素細(xì)胞(melanocyte，MC)數(shù)量變化，及異體淋巴細(xì)胞混合試驗(yàn)，揭示不同代角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞免疫原性的變化，為皮膚組織工程科學(xué)選擇種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)0.25％分離酶，0.125

2、％胰酶0.01％EDTA兩步酶法分離包皮角質(zhì)形成細(xì)胞，按不同密度接種，K-SFM、FAD培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，觀察原代融合生長(zhǎng)時(shí)間，傳代生長(zhǎng)情況。 (2)ATP酶化學(xué)染色，免疫組化檢測(cè)各代角質(zhì)形成細(xì)胞中朗格漢斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞數(shù)量的變化。 (3)將凍存的不同代數(shù)人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，分別與健康的同種異體志愿者的外周血淋巴細(xì)胞混合，建立異體細(xì)胞體外免疫排斥模型。通過(guò)H3-TdR標(biāo)記，液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)異體淋巴細(xì)

3、胞增殖情況。 結(jié)果：(1)采用中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法，真、表皮容易分離，臺(tái)盼蘭染色，活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的95％以上。原代角質(zhì)形成細(xì)胞接種密度在1×105/cm2～5×105/cm2時(shí)，細(xì)胞貼壁好，增殖速度快，體外培養(yǎng)周期顯著縮短。與FAD培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較，K-SFM培養(yǎng)的細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，數(shù)代后細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞仍然十分相似，且生長(zhǎng)較快。 (2)ATP酶染色僅在表皮鋪片中呈陽(yáng)性。免疫組化染色原代角質(zhì)形成細(xì)

4、胞中混有5.8％朗格漢斯細(xì)胞和8.1％黑色素細(xì)胞，Ⅰ代角質(zhì)形成細(xì)胞中混有2.1％朗格漢斯細(xì)胞和2.8％黑色素細(xì)胞。從Ⅱ代開(kāi)始，角質(zhì)形成細(xì)胞混雜的朗格漢斯細(xì)胞和黑色素細(xì)胞均消失。 (3)異體淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，cpm值隨角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞代數(shù)增高，逐漸降低。原代、Ⅰ代角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞cpm值下降明顯，Ⅱ代、ⅡⅢ代、Ⅳ代、Ⅴ代cpm值下降程度減弱，尤以成纖維細(xì)胞明顯。 結(jié)論：(1)本研究摸索出來(lái)一套適合組織工程