AZIN1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性轉(zhuǎn)化的實驗研究.pdf

1、目的：多胺(腐胺、精脒、精胺)參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等重要生命過程，細(xì)胞內(nèi)多胺代謝紊亂也與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。鳥氨酸脫羧酶抗酶抑制因子-1(AZIN1)是重要的多胺代謝調(diào)節(jié)蛋白，它通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞的生長。本研究的前期工作發(fā)現(xiàn)一個迄今尚未見報道的重要現(xiàn)象，即將高表達(dá)AZIN1的B16-F1小鼠黑素瘤活細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)后，出現(xiàn)先成瘤后逐漸消退的現(xiàn)象，同時在這種腫瘤自愈的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了很強(qiáng)的針對同種腫瘤細(xì)胞的免疫

2、殺傷效應(yīng)，提示高表達(dá)AZIN1可能使B16-F1腫瘤細(xì)胞發(fā)生了免疫原性轉(zhuǎn)化。為了驗證上述假說，本實驗將在細(xì)胞和實驗動物的水平上，分析AZIN1對腫瘤細(xì)胞免疫原性的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　(1) AZIN1的原核表達(dá)純化及抗體制備：pET-28a/AZIN1原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用Ni-NTA樹脂于變性條件下親和層析純化人AZIN1蛋白，然后將純化的AZIN1蛋白用作

3、抗原免疫小鼠后制備小鼠抗人AZIN1多克隆抗體；
　　(2) AZIN1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞活化BMDC分析：將pcDNA3.1(+)AZIN1真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B16-F1小鼠黑素瘤細(xì)胞，Western Blot和qPCR鑒定穩(wěn)定高表達(dá)AZIN1的細(xì)胞株(B16/O)，從小鼠股骨和脛骨中提取骨髓細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)分化獲得骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)，將B16/O細(xì)胞培養(yǎng)上清與BMDC共培養(yǎng)，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測其對BMDC活化

4、的能力；
　　(3) AZIN1蛋白復(fù)合體活化抗腫瘤免疫效應(yīng)分析：用包被有AZIN1抗體的免疫磁珠從B16-F1小鼠黑色素瘤細(xì)胞中分離得到AZIN1蛋白復(fù)合物，將分離得到的AZIN1蛋白復(fù)合物免疫小鼠，兩次免疫之后在小鼠皮下接種B16-F1小鼠黑色素瘤活細(xì)胞，然后觀察各組小鼠的成瘤及腫瘤生長情況。取免疫后的小鼠脾臟，分離得到脾臟淋巴細(xì)胞，乳酸脫氫酶釋放實驗（LDH）檢測脾臟淋巴細(xì)胞對B16-F1小鼠黑色素瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)，本實驗以原

5、核表達(dá)純化的AZIN1蛋白和生理鹽水為對照；
　　(4) AZIN1結(jié)合腫瘤抗原分析：用免疫磁珠分離AZIN1蛋白復(fù)合物后，采用蛋白質(zhì)譜法分析與AZIN1結(jié)合的蛋白分子，并從中篩選和驗證其中可能存在的腫瘤相關(guān)抗原；
　　(5) AZIN1對腫瘤細(xì)胞免疫原性轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)的影響：從穩(wěn)定高表達(dá)AZIN1的B16-F1細(xì)胞和對照細(xì)胞中提取RNA，通過轉(zhuǎn)錄組測序，分析高表達(dá)AZIN1對B16-F1細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，然后探索AZ

6、IN1高表達(dá)是否通過對相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控而參與腫瘤細(xì)胞的免疫原性轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果：
　　(1)成功原核表達(dá)與純化了人AZIN1蛋白并以此為抗原制備出抗AZIN1小鼠多克隆抗體，該抗體特異性高，可用于AZIN1的Western Blot、細(xì)胞免疫組織化學(xué)和ELISA分析；
　　(2)成功獲得高表達(dá)AZIN1的B16-F1細(xì)胞株B16/O，該細(xì)胞中AZIN1蛋白表達(dá)水平比對照細(xì)胞高5.9倍，mRNA表達(dá)水平比對照組細(xì)胞高1

7、8倍；
　?。?）用B16/O細(xì)胞條件性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)BMDC，能更有效地使后者活化；
　?。?）從B16-F1腫瘤細(xì)胞中分離的AZIN1蛋白復(fù)合物免疫小鼠后，在小鼠體內(nèi)激發(fā)了抗同種腫瘤的免疫效應(yīng)，與對照組小鼠比較，免疫AZIN1蛋白復(fù)合物組的小鼠成瘤率更低，腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量更小，小鼠血清中INF-γ、IL-12的含量顯著性升高；AZIN1蛋白復(fù)合物免疫小鼠后，與其它組小鼠相比，AZIN1蛋白復(fù)合物組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞能在體

8、外高效殺傷B16-F1細(xì)胞；
　?。?）對與AZIN1結(jié)合的蛋白質(zhì)已經(jīng)完成質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)采集工作，從中發(fā)現(xiàn)多個候選蛋白（潛在的腫瘤抗原或抗原提呈蛋白），對這些蛋白的驗證實驗及其在AZIN1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞免疫原性轉(zhuǎn)化中的作用將進(jìn)一步的研究；
　　（6）轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)AZIN1高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜產(chǎn)生了影響，目前已確定多個候選基因用于下一步驗證。
　　結(jié)論：本研究的階段性研究結(jié)果初步提示，AZIN1可能具