Hsp70融合蛋白增強Mage-a1腫瘤疫苗的免疫原性研究.pdf

1、MAGE-Al是MAGE基因家族第一個被克隆的基因，其發(fā)現(xiàn)原于它編碼一個能被黑色素瘤病人血液中的CTL識別的腫瘤抗原。至今已鑒定出MAGE基因家族的30多個成員，這些基因表達于各種組織學類型的腫瘤，包括食道癌、非小細胞肺癌、轉移性黑色素瘤等，但是在男性生殖細胞除外的正常組織不表達。男性生殖細胞因不表達MHCⅠ類分子所以不能遞呈抗原給CTL細胞。因MAGE編碼的抗原具有嚴格腫瘤特異性，人們對其在腫瘤免疫治療中的應用產生了特別的興趣。至今己

2、鑒定出大量MAGE-Al和MAGE基因家族其它基因的MHC Ⅰ類分子表位，一些表位肽已經(jīng)進入臨床試驗階段。但是現(xiàn)有的結果表明只有小部分接受治療的病人表現(xiàn)出腫瘤消退。為了增強MAGE作為腫瘤疫苗的效應，有必要嘗試對疫苗的成分作一些改進。用粒-巨噬細胞集落刺激因子、細胞因子、熱休克蛋白等作為分子佐劑來增強疫苗的免疫原性是一個切實可行的方法。 細胞外HSP70是應用于腫瘤免疫治療中的高效佐劑，它能打破對腫瘤抗原的免疫耐受，誘導腫瘤特異

3、性的CD8<'+>T細胞的殺傷效應。細胞外HSP70的免疫輔助效應是其細胞內作為應激蛋白功能的延伸。HSP70可與抗原遞呈細胞表面的高親和力受體結合，促進抗原遞呈細胞成熟并促進與之結合的抗原肽遞呈到細胞表面。HSP70-多肽復合物中HSP70作為信號轉導的配體和抗原的載體使其能打破免疫耐受，促進腫瘤消退。HSP70-多肽復合物既能激活固有的免疫反應，又能協(xié)助抗原被MHC Ⅰ、Ⅱ類分子再次遞呈，因此HSP70-多肽復合物可以誘導特異的抗腫

4、瘤免疫反應。 為研究HSP70作為分子佐劑對MAGE-Al腫瘤疫苗的免疫增強作用，本研究先在小鼠水平研究了這一方案的可行性。本研究通過連接鼠hsp70基因和mage-al(118aa-219aa)基因片段，在原核表達載體表達出一種新的融合蛋白作為腫瘤疫苗，研究這種融合蛋白疫苗能否增強mage-al作為腫瘤疫苗的效用。 我們的結果表明hsp70和mage-al的連接能明顯增強mage-al的免疫原性。免疫小鼠后，hsp70

5、增加了mage蛋白誘導針對黑色素瘤細胞B16-mage的細胞因子分泌Th1細胞和殺傷細胞的數(shù)量，并抑制表達mage-al的B16-mage細胞在小鼠體內的生長。 本文包括兩部分：一、原核表達載體的構建和蛋白純化PCR擴增鼠hsp70基因、mage-al(118aa-219aa)基因片段和人的HSP70基因、MAGE-Al(187aa-305aa)基因片段。先亞克隆到T載體，陽性克隆經(jīng)測序驗證后，用限制性內切酶酶切，獲得4個片段，

6、克隆入原核表達載體pGEX4T-1。然后mage-al片段插入pGEX4T-1-m-hsp70載體構建pGEX4T-1-m-mage-hsp70融合蛋白表達載體， MAGE-Al 片段插入pGEX4T-1-h-HSP70載體構建pGEX4T-1-h-MAGE-HSP70融合蛋白表達載體。總共構建了6個表達載體：pGEX4T-1-m-mage、pGEX4T-1-m-hsp70、pGEX4T-1-m-mage-hsp70、pGEX4T-1-

7、h-MAGE、pGEX4T-1-h-HSP70、pGEX4T-1-h-MAGE-HSP70，全部質粒經(jīng)測序驗證沒有移碼和錯義突變。用GST親和層析柱從4個表達載體(pGEX4T-1、pGEX4T-1-m-mage、pGEX4T-1-m-hsp70和pGEX4T-1-m-mage-hsp70)純化4個蛋白(GST、mage、hsp70、mage-hsp70)，為下一步的小鼠體內免疫學實驗備用。用hsp70抗體通過蛋白印跡驗證了表達蛋白的h

8、sp70成分。 二、蛋白疫苗的小鼠體內免疫學研究用PBS對照和以上純化的4種蛋白免疫C57BL/6小鼠每周1次，2周后，分離小鼠脾淋巴細胞，用IFN-γ ELISPOT檢測針對B16-mage細胞的IFN-γ分泌Thl細胞，非放射性的細胞殺傷試劑盒檢測殺傷B16-mage細胞的CTL細胞。為研究疫苗對負載黑色素瘤B16-mage細胞小鼠的保護作用，小鼠接受蛋白免疫2次后，皮下接種B16-mage細胞。在研究疫苗對負載B16-ma

9、ge細胞小鼠的治療作用組，小鼠先皮下接種B16-mage細胞，2天后進行蛋白疫苗的注射。我們的結果表明GST和hsp70蛋白沒有免疫原性。mage蛋白有一定的免疫原性，而且hsp70與mage連接明顯增強了mage的免疫原性。小鼠經(jīng)mage、mage-hsp70蛋白免疫后脾淋巴細胞中針對B16-mage的分泌IFN-γ Th1細胞和CTL細胞數(shù)量比PBS對照、GST和hsp70蛋白組多；而且mage-hsp70蛋白組比mage組多，差異

10、有顯著性。在小鼠先接受蛋白疫苗注射，后接種腫瘤細胞的方案中，mage和博士后研究工作報告mage-hsp70蛋白都可抑制腫瘤的生長，mage-*hsp70蛋白顯示出更強的效用。在小鼠先接種腫瘤細胞，后接受蛋白疫苗注射的方案中，mage和mage-hsp70蛋白都沒有產生抑瘤效應。綜上，本研究成功構建了mage、mage-hsp70蛋白原核表達載體，并純化蛋白進行腫瘤疫苗的臨床前研究。結果表明mage、mage-hsp70蛋白都能誘導抗腫