CEA多表位基因克隆、表達及免疫原性研究.pdf

1、溫州醫(yī)學院碩士學位論文CEA多表位基因克隆、表達及免疫原性研究姓名：國強申請學位級別：碩士專業(yè)：普外科指導教師：朱冠保20090501用NiNTA樹脂親和層析法分別純化表位融合蛋白ozlf65166及His蛋白4、選擇68周齡BALB／c小鼠，將其分為三組，每組7只，分別于第0w、2w、4w將純化后的融合蛋白ozlf65／66多表位肽及His蛋白與佐劑等體積混勻后按照50ug／只劑量分別免疫小鼠，采用背部皮下多點注射的方式進行免疫，同時

2、以His蛋白及PBS作為陰性對照和空白對照。第0w、1w、3w、5w、7w斷尾取血，用ELISA方法檢測血清抗體IgG水平及其持續(xù)時間。并于小鼠初免后第6周，每組處死3只小鼠，無菌取脾細胞，采用乳酸脫氫酶LDH釋放法檢測其其特異性的CTL殺傷活性。5統(tǒng)計學分析：采用SPSSl30軟件進行分析，各組間血清抗體水平的比較和各組間CTL殺傷率比較采用兩樣本均數(shù)T檢驗，p005時有統(tǒng)計學意義。結果：1、經(jīng)酶切和測序鑒定，表明CEA多表位基因的原

3、核重組質粒PET32alCEA168183，重組質粒構建成功。2、SDSPAGE分析表明，重組質粒在37℃10mMIPTG條件下誘導6h能很好地表達目的蛋白，相對分子質量(Mr)約為20kDa，與預期Mr大小吻合；蛋白表達量均約占細菌總蛋白量的20％。，并經(jīng)Westernblot鑒定為目的蛋白。用NiNTA樹脂親和層析法純化成功獲得多表位融合蛋白，即ozlf65166，純度達到90％以上。3、小鼠實驗結果表明，CEA多表位融合蛋白能有效

4、的刺激小鼠產生特異性IgG抗體，抗體的效價隨免疫的次數(shù)逐漸加強至第7周；小鼠脾細胞CTL殺傷活性檢測結果顯示其對靶細胞具有特異性殺傷作用。結論：1、通過前期預測篩選了B細胞和CTL表位富集的多表位肽段，CEA168183(EPETQDATYLWWVNNQ)。2、通過分子克隆的方法成功構建了CEA168183多表位的原核重組質粒PET32a()／CEA168183，并在原核細胞表達系統(tǒng)內成功表達融合蛋白ozlf65／66。3、CEA168