Tim-3對(duì)炎性腸病的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell Immunoglobulin domain and Mucindomain protein-3，Tim-3)是一種最初發(fā)現(xiàn)于活化的Th1細(xì)胞表面的共刺激分子，在結(jié)構(gòu)上屬于T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白(Tim)家族成員。Tim-3分子在維護(hù)體內(nèi)免疫平衡穩(wěn)定中起重要作用?，F(xiàn)已知半乳糖結(jié)合蛋白-9(Galectin-9，Gal-9)為T(mén)im-3的天然配體，該分子廣泛表達(dá)于外周免疫系統(tǒng)，而其長(zhǎng)片

2、斷的Gal-9亞型分子則特異性表達(dá)在腸粘膜及相關(guān)淋巴組織，二者均可與Th1細(xì)胞上的Tim-3分子特異性結(jié)合，引發(fā)Th1細(xì)胞死亡，下調(diào)Th1型免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。目前已明確Tim-3分子通過(guò)調(diào)節(jié)不同CD4+T效應(yīng)細(xì)胞亞群的功能廣泛參與了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫應(yīng)答過(guò)程。而Tim-3是否參與了炎性腸病(InflammatoryBowel Diseases，IBD)的發(fā)生，在炎性腸病中起到什么樣的作用目前還不清楚。 目的

3、:探討Tim-3分子對(duì)炎性腸病的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。 方法: 利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆Tim-3胞外段基因，構(gòu)建含有小鼠Tim-3胞外段基因的Tim-3_pET32a(+)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，用鎳柱親和純化目的蛋白，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot方法驗(yàn)證目的蛋白的純度和特異性。通過(guò)直腸灌注三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfo

4、nic acid，TNBS)的方法建立炎性腸病小鼠模型—TNBS-結(jié)腸炎，從體重、死亡情況，結(jié)腸大體及組織學(xué)改變和細(xì)胞因子變化等方面對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。在TNBS-結(jié)腸炎小鼠的基礎(chǔ)上腹腔注射Tim-3蛋白，從體重、死亡情況，結(jié)腸大體及組織學(xué)改變等方面觀(guān)察Tim-3蛋白對(duì)結(jié)腸炎小鼠的影響。通過(guò)ELISA檢測(cè)IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-23、TGF-β水平的變化，通過(guò)FACS檢測(cè)小鼠外周血中Tim-3+細(xì)胞的表達(dá)和小鼠脾細(xì)胞、腸系膜

5、淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的表達(dá)及共刺激分子CD28、CD80、CD86、CTLA-4的表達(dá)，通過(guò)Real-time PCR法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞中Tim-3和Foxp3的表達(dá)。 結(jié)果:成功克隆了小鼠Tim-3基因及其胞外段基因片段；實(shí)現(xiàn)了小鼠Tim-3分子的可溶性原核表達(dá)。成功建立了炎性腸病小鼠模型，表現(xiàn)在建模后小鼠出現(xiàn)松毛、精神萎靡、少食、腹瀉、體重下降、死亡等癥狀；結(jié)腸縮短、腸壁增厚，水腫、炎性滲出，呈節(jié)段性炎性改變；結(jié)腸

6、發(fā)生透壁性炎癥，腸壁結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；IFN-γ水平升高、IL-4水平降低，IL-17水平升高，小鼠出現(xiàn)Th1、Th17細(xì)胞偏移；前炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯升高。在TNBS-結(jié)腸炎建模前12hr腹腔注射Tim-3蛋白能夠明顯加重小鼠結(jié)腸炎癥狀，表現(xiàn)在小鼠體重明顯下降和死亡率明顯增加，結(jié)腸大體標(biāo)本和組織切片結(jié)果均提示結(jié)腸炎小鼠病理?yè)p傷進(jìn)一步加重，并且結(jié)腸炎癥狀與小鼠體內(nèi)Tim-3+細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān)；前炎性因子IFN-