NLRP3炎性體對(duì)機(jī)械通氣所致肺損傷的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景：
　　機(jī)械通氣是重要的生命支持手段也會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥急性肺損傷，即機(jī)械通氣所致肺損傷(ventilator-induced lung，VILI)，加重免疫系統(tǒng)功能的紊亂，影響呼吸窘迫綜合征等重癥患者預(yù)后。但機(jī)械通氣致肺損傷作用機(jī)制有待探討。因此，開展VILI機(jī)制研究，對(duì)探尋防治VILI的措施、改善患者預(yù)后具有重要意義。
　　研究表明固有免疫在機(jī)械通氣所致肺損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用，明確機(jī)械通氣引發(fā)的免疫效應(yīng)及其分子機(jī)制對(duì)

2、于VILI的預(yù)防和治療至為關(guān)鍵。機(jī)械牽張誘發(fā)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致彌漫性肺泡的損害，病理特征包括滲透性的肺水腫、透明膜的形成以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、促炎因子釋放等。
　　肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)是重要的靶細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞消減可以明顯改善機(jī)械通氣所致肺損傷。肺泡巨噬細(xì)胞大約占肺泡腔外周細(xì)胞數(shù)的5％左右，機(jī)械通氣可以快速激活A(yù)Ms并可能在VILI發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其中包含促炎細(xì)胞因子白介素-1β(interleukin-

3、1β，IL-1β)和IL-18釋放，IL-1β受體拮抗劑和抗IL-1β抗體都可以減輕患者急性肺損傷炎性反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18是機(jī)械通氣肺損傷肺部炎癥的明確標(biāo)記。
　　IL-1β和IL-18產(chǎn)生與炎性體的激活有密切關(guān)聯(lián)。炎性體(Inflammasome)是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，可以調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)。主要的炎性體有:NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF、AIM2炎性體等。其中NLRP3炎性體可感知

4、傷害性刺激信號(hào)而被激活，傷害性刺激包括組織損傷、代謝、應(yīng)激、感染等，現(xiàn)在已知其參與了多種無(wú)菌性炎性疾病進(jìn)程。NLRP3炎性體復(fù)合體被激活后進(jìn)一步激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-1，后者的成熟體通過(guò)蛋白水解作用切割加工促炎細(xì)胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18成熟并促進(jìn)它們分泌。然而，機(jī)械力被細(xì)胞感受以及被轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)并傳導(dǎo)入細(xì)胞的機(jī)制、機(jī)械通氣導(dǎo)致IL-1β和IL-18釋放機(jī)制尚不明確，本文首次探討了NLRP3炎性體機(jī)械

5、牽張肺損傷的調(diào)節(jié)作用。
　　我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，機(jī)械牽張可以促使線粒體ROS產(chǎn)生。研究表明抑制或清除ROS可明顯抑制NLRP3的激活。最初的假設(shè)是ROS來(lái)源于吞噬相關(guān)NADPH氧化酶ROS，但是隨后的研究表明NADPH基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)中，NLRP3炎性體的激活并未受明顯影響。說(shuō)明ROS可能來(lái)源于另一重要途徑:線粒體ROS。其他研究證據(jù)表明:線粒體ROS是NLRP3炎性體激活所需的主要因素，線粒體功能障礙誘發(fā)NLRP3炎性體激活。另外

6、我們發(fā)現(xiàn)VILI伴隨NLRP3炎性體激活。
　　機(jī)械牽張是否通過(guò)調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生影響NLRP3炎性體的激活呢？相關(guān)研究未見報(bào)道，據(jù)此，我們提出假說(shuō):機(jī)械牽張可能激活ROS依賴性NLRP3炎性體/炎性因子通路，最終導(dǎo)致肺損傷。
　　研究目的：
　　明確機(jī)械通氣對(duì)NLRP3炎性體活性的影響，并探討其作用機(jī)制;探討VILI中ROS對(duì)NLRP3炎性體活性的影響;明確ROS/NLRP3/炎性因子信號(hào)通路對(duì)VILI的調(diào)節(jié)作用。

7、r>　　研究方法：
　　本研究通過(guò)肺泡巨噬細(xì)胞、基因敲除小鼠、小鼠VILI模型等研究對(duì)象，采用Western Blot、siRNA轉(zhuǎn)染基因下調(diào)、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等手段，多層面探討機(jī)械通氣肺損傷中ROS/NLRP3炎性體/細(xì)胞因子IL-1β通路的調(diào)節(jié)作用，為探尋防治機(jī)械通氣肺損傷對(duì)策提供新的理論依據(jù)。
　　第一部分機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號(hào)通路
　　1.1、肺泡巨噬細(xì)胞分離提取和機(jī)械牽

8、張
　　從C57BL/6JSD小鼠支氣管肺泡灌洗液分離收集肺泡巨噬細(xì)胞，將收集的AMs種植在6孔彈性底培養(yǎng)皿內(nèi)(Bio Flex baseplate)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的MCDB-131培養(yǎng)基（不含抗生素）;細(xì)胞種植密度為1.0×105/cm2，培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)鋪0.1％膠原蛋白Ⅳ，置于5％CO2-95％空氣的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃，飽和濕度）。BioFlex培養(yǎng)皿固定在FX-4000T Flexercell細(xì)胞環(huán)形牽張儀(Fle

9、xcell International，McKeesport，PA)25-mmBioFlex承載臺(tái)，進(jìn)行牽張模擬機(jī)械通氣，內(nèi)環(huán)境5％CO2-95％空氣（37℃，飽和濕度）。計(jì)算機(jī)設(shè)定牽張參數(shù)，牽張頻率30cycles/min(0.5Hz)，牽張/松弛比率1∶1。培養(yǎng)皿底部牽張度分別設(shè)定為8、15、和20％，分別對(duì)應(yīng)機(jī)械通氣肺通氣量為50、64、80％的肺活量，牽張時(shí)間設(shè)為4h。不同牽張時(shí)間設(shè)定為0（對(duì)照）、1、2、4小時(shí)，牽張度設(shè)為20

10、％。
　　1.2、siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)
　　選擇合適siRNA下調(diào)相關(guān)基因表達(dá):NLRP3/AIM2/IPAF。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋siRNA和Dharma FECT轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育5分鐘，混合后室溫孵育20分鐘，加入無(wú)抗生素的完全培養(yǎng)基。換成轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，在37℃孵育24-48小時(shí)。設(shè)立轉(zhuǎn)染試劑、陰性、陽(yáng)性對(duì)照。
　　1.3、ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含

11、量變化。
　　1.4、Western Blot和IP檢測(cè)各組NLRP3/ASC/Caspase-1表達(dá)及相互作用、IL-1β和IL-18含量。
　　采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，提純后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后用WB測(cè)定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18含量等，最后用ImageJ軟件分析。
　　第二部分機(jī)械牽張激活NLRP3炎性體信號(hào)通路需要線粒體ROS
　　2.1、分離C57BL/6

12、JSD小鼠，gp91phox-/-小鼠AMs，不同組予以ROS抑制劑、激活劑，ROS熒光標(biāo)記試劑預(yù)處理后進(jìn)行機(jī)械牽張實(shí)驗(yàn)。
　　2.2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體ROS變化
　　避光10μM MitoSOX Red (Invitrogen-Molecular Probes)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)細(xì)胞30min，進(jìn)入各組牽張實(shí)驗(yàn)流程，然后胰蛋白酶-EDTA收集細(xì)胞，將各試驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞技術(shù)專用試管，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體ROS表達(dá)，驗(yàn)

13、證機(jī)械牽張是否通過(guò)線粒體ROS激活NLRP3炎性體。
　　2.3、Western Blot檢測(cè)NLRP3炎性體表達(dá)
　　采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，提純后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后用WB測(cè)定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18含量等，最后用ImageJ軟件分析。
　　2.4、ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量變化。
　　第

14、三部分機(jī)械通氣對(duì)小鼠肺NLRP3炎性體的激活作用
　　3.1、VILI模型建立
　　按照文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)方案，建立機(jī)械通氣肺損傷肺損傷模型。
　　3.2、NLRP3炎性體表達(dá)
　　機(jī)械通氣后分別取各組支氣管肺泡灌洗液和肺組織，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量變化。ELISA法檢測(cè)各組支

15、氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量變化。
　　3.3、線粒體ROS拮抗劑SS-31預(yù)處理
　　實(shí)驗(yàn)小鼠SS-31霧化吸入預(yù)處理24h，機(jī)械通氣后分別取各組支氣管肺泡灌洗液和肺組織，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1以及IL-1β和IL-18含量變化。Elisa法檢測(cè)各組支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分:機(jī)

16、械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號(hào)通路
　　機(jī)械牽張引起肺泡巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β釋放，并隨牽張時(shí)間延長(zhǎng)、牽張程度增大而增強(qiáng)。CS誘發(fā)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞IL-1β釋放具有caspase-1依賴性。Caspase-1抑制劑明顯減少IL-1β含量。機(jī)械牽張激活小鼠肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號(hào)通路，而非其他炎性體通路。
　　第二部分:機(jī)械牽張激活NLRP3炎性體信號(hào)通路需要線粒體ROS

17、　　機(jī)械牽張誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生。機(jī)械牽張激活A(yù)MsNLRP3炎性體需要線粒體ROS。NADPH氧化酶ROS未參與機(jī)械牽張所致NLRP3炎性體激活。機(jī)械牽張可能通過(guò)AMs尿酸釋放致線粒體ROS產(chǎn)生并激活NLRP3炎性體。
　　第三部分:機(jī)械通氣激活小鼠肺ROS/NLRP3炎性體/IL-1β通路
　　高潮氣量機(jī)械通氣激活小鼠肺NLRP3炎性體。線粒體ROS抑制劑SS-31抑制機(jī)械通氣所致NLRP3炎性體激活，并降低

18、IL-1β和IL-18產(chǎn)生量。通過(guò)肺泡巨噬細(xì)胞消減技術(shù)證明VILI中肺泡巨噬細(xì)胞起關(guān)鍵作用。IL-1β受體拮抗劑減輕機(jī)械通氣所致肺損傷炎性反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞線粒體ROS依賴性NLRP3炎性體信號(hào)通路并導(dǎo)致炎性因子IL-1β和IL-18釋放，是VILI早期的重要機(jī)制。
　　創(chuàng)新點(diǎn)及意義：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張通過(guò)激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)Caspase-1的活化及IL-1β和IL-