納米氧化鋅對(duì)NLRP3炎性小體的激活作用及機(jī)制.pdf

1、背景:
　　納米氧化鋅（Zinc Oxide Nano-Particles，ZnO-NPs)是一種新型高功能無機(jī)精細(xì)產(chǎn)品，具有宏觀材料所不具備的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)以及宏觀隧道效應(yīng)、高分散性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于陶瓷、化工、電子、光學(xué)、生物、醫(yī)藥、國(guó)防等許多領(lǐng)域。與此同時(shí)，納米氧化鋅的毒性作用也受到了人們的廣泛關(guān)注。納米氧化鋅主要通過呼吸道進(jìn)入機(jī)體，由于其具有較小粒徑，可進(jìn)入到肺泡深部，誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞活性氧（Reactive

2、Oxygen Species，ROS）生成量增多，誘發(fā)炎性反應(yīng)。NLRP3（Nod-liker Recptor Protein3，NLRP3）炎性小體是炎性反應(yīng)的重要組成部分，是由 NLRP3分子、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD， ACS）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate prote

3、ase-1，caspase-1)組成的分子量約為700 kD的蛋白復(fù)合體，可以被ROS活化。活化的NLRP3炎性小體可以切割炎性因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18前體，促進(jìn)其成熟釋放，從而誘導(dǎo)其他炎性因子的分泌，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)展進(jìn)程。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）可以調(diào)控NLRP3炎性小體的活化，促進(jìn)炎性因子的分泌。然而，納米氧化鋅引發(fā)炎性反應(yīng)中

4、NLRP3炎性小體是否被活化并發(fā)揮作用未見報(bào)道。
　　本課題選用人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（A549）作為研究對(duì)象，以納米氧化鋅顆粒物（ZnO-NPs）作為刺激物，研究 NLRP3炎性小體的活化在 ZnO-NPs誘發(fā)A549細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用：
　　不同濃度（0、10、20、40μg/mL）ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞4、8、24 h，染毒

5、結(jié)束后收集各組細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光信號(hào)強(qiáng)度（Mean Fluorescence Intensity，MFI）來反映各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平；應(yīng)用丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。
　　2、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化作用：
　　不同濃度Zn

6、O-NPs刺激A549細(xì)胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞。應(yīng)用蛋白印跡法（Western Blot，WB）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65的表達(dá)水平以反映細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化水平。
　　3、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的激活作用：
　　不同濃度ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞12 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescent quantitative Po

7、lymerase Chain Reaction，Real-time PCR）檢測(cè)NLRP3 mRNA的表達(dá)水平；ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1活性小亞基 p10的蛋白表達(dá)水平；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay，ELISA）檢測(cè)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL

8、-18的表達(dá)水平。
　　4、抑制劑對(duì)通路的影響：
　　4.1活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）對(duì)NF-κB、NLRP3炎性小體活化的影響：
　　NAC預(yù)處理A549細(xì)胞后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清。應(yīng)用 Western Blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)磷酸化 p65、NLRP3、caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達(dá)量；應(yīng)用EL

9、ISA檢測(cè)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。
　　4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082（BAY）對(duì)ROS、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響：
　　BAY11-7082預(yù)處理A549細(xì)胞后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞8 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞 ROS的表達(dá)水平；BAY11-7082預(yù)處理A549后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞及

10、培養(yǎng)上清，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)NLRP3、caspase-1活性小亞基p10的表達(dá)量；應(yīng)用ELISA檢測(cè)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)水平。
　　4.3 NLRP3抑制劑格列本脲（Glibenclamide，GEL）對(duì)炎性因子 IL-1β、IL-18的影響：
　　GEL預(yù)處理A549細(xì)胞后用ZnO-NPs刺激A549細(xì)胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA

11、分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。
　　結(jié)果:
　　1、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用：
　　相同染毒劑量下，各組細(xì)胞ROS水平和MDA的含量隨著染毒時(shí)間的增加而升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相同染毒時(shí)間下，隨著染毒劑量的增加，ROS水平與MDA含量也隨之增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SOD的活性隨著染毒時(shí)間與劑量的增加呈下降趨勢(shì)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、（P＜0.05）。
　　2、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NF-κB活化水平的影響：
　　WB結(jié)果顯示，0、10、20、40μg/mL劑量組磷酸化p65的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.23、0.45、0.96、1.12；隨著染毒劑量的增加，NF-κB的活化水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。
　　3、ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的影響：
　　3.1 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞NLRP3與caspase-1表達(dá)的影響：

13、
　　Real Time-PCR結(jié)果顯示NLRP3 mRNA的表達(dá)水平隨著染毒劑量增加而升高，各劑量組與對(duì)照組相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果表明，隨著染毒劑量的增加，NLRP3炎性小體與Caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達(dá)水平也隨之升高。
　　3.2 ZnO-NPs對(duì)A549細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平的影響：
　　ELISA結(jié)果顯示，各組細(xì)胞炎性因子I

14、L-1β和IL-18的含量隨著染毒劑量的增加升高。與對(duì)照組相比較，20、40μg/mL劑量組IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與10μg/mL組相比較，40μg/mL劑量組IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4應(yīng)用抑制劑對(duì)信號(hào)通路的影響：
　　4.1 ROS抑制劑NAC對(duì)NF-κB、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響：
　　與對(duì)照組比

15、較，ZnO-NPs刺激可明顯提高細(xì)胞內(nèi)磷酸化 p65、NLRP3與Caspase-1活性小基 p10的蛋白表達(dá)水平，可使細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 IL-1β、IL-18的含量升高。NAC預(yù)處理可顯著降低ZnO-NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65、NLRP3、p10的蛋白高表達(dá)和IL-1β、IL-18的高表達(dá)。
　　4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082對(duì)ROS、NLRP3炎性小體表達(dá)水平的影響：
　　ZnO-NPs刺激8h后ROS

16、表達(dá)水平（用MFI表示）為9543.44±272.81，應(yīng)用NF-κB抑制劑BAY11-7082后ROS表達(dá)水平為9042.65±314.19，兩組相比ROS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。WB結(jié)果顯示，BAY11-7082預(yù)處理可顯著降低ZnO-NPs誘導(dǎo)的NLRP3與p10的高表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示，ZnO-NPs刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)水平分別為（1.60±0.09）μg/mL、（739.0

17、2±29.40）pg/mL，BAY11-7082預(yù)處理后IL-1β、IL-18的表達(dá)水平分別為（1.08±0.12）μg/mL、（331.27±70.65） pg/mL，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.3 NLRP3抑制劑格列本脲對(duì)炎性因子IL-1β、IL-18的影響：
　　ZnO-NPs刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子 IL-1β、IL-18表達(dá)水平分別為（1.60±0.09）μg/mL、（739.02±29.