活性氧激活NLRP3炎癥小體啟動干眼炎癥反應(yīng)的機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 活性氧激活的NLRP3炎癥小體在小鼠干眼發(fā)病中的機制研究
　　目的:研究活性氧(ROS)在小鼠環(huán)境誘導(dǎo)型干眼發(fā)病過程中的作用，并確定ROS是否通過激活NLRP3炎癥小體來介導(dǎo)干眼炎癥反應(yīng)。
　　方法:研究采用本課題組開發(fā)的智能控制環(huán)境系統(tǒng)(ICES)創(chuàng)建小鼠干眼模型，在這個系統(tǒng)中相對濕度、空氣流速和溫度分別維持在15.3±3％，2.1±0.2m/s和21-23℃。將C57

2、BL/6系雌性小鼠（4-6周齡）置于ICES系統(tǒng)中1周、2周以誘導(dǎo)干眼，并予配置的0.3％ N-acetyl-L-cysteine(NAC，ROS抑制劑)眼水局部點眼，觀察其對干眼形成的抑制效果。實驗分為5組:1）置于正常環(huán)境并無干預(yù)措施的正常對照組;2）置于ICES中1周組;3）置于ICES中2周組;4）置于ICES中并同時雙眼予0.3％ NAC眼水點眼2周組;5）置于ICES中并同時雙眼予生理鹽水(NS)點眼2周組。在實驗第0、1、

3、2周進行所有實驗動物的臨床眼表評估（角膜熒光染色評分），后分別取各組小鼠角膜、結(jié)膜組織或完整眼球。ROS試劑盒檢測組織中ROS水平，應(yīng)用Real Time-PCR、免疫熒光共聚焦顯微鏡、ELISA等方法檢測評估角膜、結(jié)膜組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β表達情況，并用熒光試劑盒檢測Caspase-1的活性程度。
　　結(jié)果:小鼠角膜熒光素鈉染色評分隨ICES時間延長逐漸增加，ICES1周時點染有少量增加，但I

4、CES2周點染顯著多于正常對照組和ICES1周組。ROS在小鼠角膜、結(jié)膜中的表達在ICES1周開始即有明顯的持續(xù)性增多。Real Time-PCR結(jié)果示角膜、結(jié)膜組織NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β的基因表達在ICES1周時與正常對照組無差異，但在ICES2周時表達顯著升高;免疫熒光共聚焦顯微鏡半定量檢測NLRP3、Caspase-1、和IL-1β的蛋白表達水平與基因表達情況一致。Caspase-1活性在ICES1周

5、時與正常對照組無差異，但ICES2周時明顯增強。ROS抑制劑NAC眼水點眼2周后小鼠角膜熒光素鈉染色顯著下降，接近正常水平;其角膜、結(jié)膜中的ROS表達也明顯降低，同時NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β的基因和蛋白表達量及Caspase-1的活性，均明顯低于NS對照組。
　　結(jié)論:ROS的過表達參與環(huán)境誘導(dǎo)性干眼的發(fā)病，其通過激活NLRP3炎癥小體從而介導(dǎo)干眼炎癥介質(zhì)IL-1β的過表達。ROS-NLRP3-IL-1

6、β這一事件軸的激活可能是環(huán)境誘導(dǎo)性干眼的啟動程序。
　　第二部分 高滲刺激的人角膜上皮細胞NLRP3炎癥小體作用的機制研究
　　目的:以高滲刺激下的人角膜上皮細胞株(HCECs)為對象，研究ROS、胞內(nèi)受體NLRP3及炎癥因子IL-1β在RO S-NLRP3-IL-1β信號通路中的各自地位和作用。
　　方法:首先檢測不同程度高滲透壓刺激后HCECs中ROS及NLRP3炎癥小體各聚合成分（NLRP3、ASC和Caspas

7、e-1）和IL-1β的mRNA的相對表達量的變化趨勢，并選擇出最佳高滲透壓進行后續(xù)實驗。第二，以310 mOsm為等滲對照組、500 mOsm為高滲對照組，比較予ROS抑制劑NAC20mM預(yù)處理的HCECs對500 mOsm高滲刺激的反應(yīng)。用ROS探針氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯檢測細胞中ROS水平，Real-time PCR檢測NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表達量，Western blot檢測NLRP3的蛋白表

8、達，并分別用熒光試劑盒和ELISA定量檢測細胞中Caspase-1的活性程度和細胞培養(yǎng)上清液中活性IL-1β的含量。第三，設(shè)計合成靶向人NLRP3的干擾RNA，轉(zhuǎn)染至HCECs后再予500 mOsm高滲刺激，設(shè)等滲、高滲對照組和陰性轉(zhuǎn)染對照組，同樣方法檢測細胞中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表達、NLRP3的蛋白表達，及Caspase-1的活性程度和細胞培養(yǎng)上清液中活性IL-1β的含量。
　　結(jié)果:HCE

9、Cs中ROS水平及NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達在高滲透壓到一定程度后（500 mOsm以上）才出現(xiàn)明顯的升高，500 mOsm對本細胞株是較佳的刺激程度。NAC預(yù)處理的HCECs對500 mOsm高滲刺激反應(yīng)下調(diào)，與高滲對照組相比，其細胞內(nèi)ROS被基本清除，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達下降，同時NLRP3的蛋白表達也降低，Caspase-1活性減弱，細胞培養(yǎng)上清液中

10、活性IL-1β的含量下降。成功轉(zhuǎn)染NLRP3干擾RNA后的HCECs中NLRP3基因表達被抑制，對500 mOsm高滲刺激無明顯反應(yīng)，與轉(zhuǎn)染陰性對照組相比，其NLRP3炎癥小體各成分的mRNA表達降低，Caspase-1活性減弱，分泌的活性IL-1β也減少。
　　結(jié)論:高滲刺激的HCECs，首先使ROS的生成迅速增多，ROS再激活NLRP3炎癥小體使其分泌過量的活性IL-1β，這個過程中ROS、NLRP3和IL-1β存在有序性信號

11、傳導(dǎo)，提示RO S-NLRP3-IL-1β信號通路對啟動干眼炎癥反應(yīng)的重要啟動作用。
　　第三部分 ROS-NLRP3-I L-1β信號通路在外環(huán)境性干眼患者中的初步驗證
　　目的:研究臨床外環(huán)境性干眼患者結(jié)膜上皮細胞和淚液樣本中ROS、模式識別受體NLRP3及炎癥因子IL-1β相對于正常人的表達差異，以驗證ROS-NLRP3-1L-1β信號通路是否參與臨床干眼的發(fā)病過程。
　　方法:實驗對象為單純由低濕度、高風(fēng)速環(huán)境

12、，或職業(yè)環(huán)境因素如過長時間的視頻終端儀器(VDT)的使用引起的臨床外環(huán)境性干眼患者，并且符合眼表自覺癥狀OSDI(Ocular Surface Disorder Index)評分＞20分且淚膜破裂時間(TBUT)＜5s，入選符合標準的干眼患者20例和正常對照組15例。結(jié)膜印跡細胞法取結(jié)膜上皮細胞，高速離心法收集Schirmer試紙中的淚液，用ROS探針二氯二氫熒光素二乙酯檢測結(jié)膜上皮細胞中ROS水平，Real-time PCR檢測其NL

13、RP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表達量，并用ELISA試劑盒定量檢測淚液中活性IL-1β的含量。
　　結(jié)果:外環(huán)境性干眼病人組中男性7例，女性13例，年齡為33.5±7.3歲;正常組男性5例，女性10例，年齡為30.3±6.5歲，兩組間性別比及年齡均無統(tǒng)計學(xué)差異。干眼組OSDI分值36.35±10.70，正常組為3.45±2.05，兩組差異顯著(P＜0.001);干眼組TBUT為3.13±1.22s，明顯低于正

14、常組的11.93±1.39s(P＜0.001);SchirmerⅠ試驗在干眼組為7.13±3.63mm/5 min，也明顯小于正常組的12.6±2.52mm/5min(P＜0.001)。干眼組結(jié)膜上皮細胞中ROS水平，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA水平及淚液中活性IL-1β的含量都顯著高于正常組(P≤0.023)。且干眼組淚液樣本中的活性IL-1β水平與OSDI分值呈正相關(guān)（R2=0.402，P=0.003