TXNIP調(diào)控Kupffer細(xì)胞中NLRP3炎癥小體通路激活在NAFLD進(jìn)展過程中的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：Kupffer細(xì)胞及IL-1β與患者NAFLD進(jìn)展的關(guān)系
　　目的：比較單純性脂肪肝（NAFL）與脂肪性肝炎（NASH）患者的臨床血清學(xué)指標(biāo)及組織病理學(xué)結(jié)果，初步探討Kupffer細(xì)胞（KCs）及IL-1β與NASH發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：根據(jù)NAFLD納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，收集高度懷疑或術(shù)前影像學(xué)診斷為NAFLD患者的肝臟標(biāo)本，首先制作石蠟切片進(jìn)行 HE染色，通過NAFLD活動(dòng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將患者分為正常組、NAFL組及N

2、ASH組，其次比較各組患者血清轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、游離脂肪酸（FFA）及IL-1β的水平，最后通過F4/80免疫組化及天狼星紅染色法，觀察各組肝組織中KCs的聚集情況及膠原纖維的增生情況。
　　結(jié)果：
　?。?）本次共收集8例肝臟標(biāo)本，經(jīng)NAS評(píng)分診斷NASH3例，NAFL3例，正常肝臟2例。
　　（2）正常組及NAFL組患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯、FFA水平均在正常范圍內(nèi)，血清IL-1

3、β低于檢測下限。NASH組患者血清ALT、AST及甘油三脂均在正常參考值范圍，F(xiàn)FA及IL-1β水平高于正常組及NAFL組（P<0.05）。
　?。?）NAFL及NASH肝組織F4/80表達(dá)陽性細(xì)胞（KCs）較正常肝臟組織明顯增多，在肝細(xì)胞脂肪變的區(qū)域KCs聚集較多；天狼星紅染色結(jié)果顯示NASH組肝組織膠原纖維增生程度較NAFL及正常肝臟組無明顯增加。
　　結(jié)論：血清FFA、KCs及促炎因子IL-1β可能參與人體NAFL向N

4、ASH的發(fā)展。
　　第二部分：抑制TXNIP與NLRP3基因的表達(dá)對(duì)Kupffer細(xì)胞中NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響
　　目的：觀察敲除小鼠硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）基因與NLRP3基因?qū)FA激活NLRP3炎癥小體及促進(jìn)促炎因子IL-1β分泌的影響，探討FFA激活NLRP3炎癥小體的具體機(jī)制。
　　方法：取野生型（WT）C57BL/6小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠，采用肝臟在體PBS灌

5、注，離體膠原酶消化、梯度離心聯(lián)合選擇性貼壁法分離各組小鼠KCs，F(xiàn)4/80免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)鑒定KCs的純度，吞墨實(shí)驗(yàn)判斷KCs的吞噬功能，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察KCs隨時(shí)間的形態(tài)變化。將分離培養(yǎng)48 h的KCs以2-3×106密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶及激光共聚焦培養(yǎng)皿中，并隨機(jī)分為2組：①FFA組（FFA Group）：給予濃度為0.3mM的棕櫚酸（Palmitic acid,PA）刺激；②對(duì)照組(CON Group)：不給予任何刺

6、激。于處理后8h收獲細(xì)胞。光鏡及透射電鏡觀察KCs的形態(tài)變化，熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1 mRNA表達(dá)變化，Western blotting檢測TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)水平，激光共聚焦檢測TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表達(dá)情況，ELISA法測定 KCs培養(yǎng)上清液中IL-1β水平。
　　結(jié)果：
　?。?）免疫熒光染色可見

7、KCs細(xì)胞膜高表達(dá)F4/80分子，提取的KCs純度大于90％，吞墨實(shí)驗(yàn)可見KCs吞噬大量碳素顆粒。
　?。?）FFA組與CON組KCs光鏡下形態(tài)無明顯差異，透射電鏡下可見FFA組KCs吞噬大量脂滴。
　?。?）WT小鼠FFA組與CON組TXNIP、ASC及 Caspase-1的mRNA表達(dá)量無顯著性差異（P>0.05），F(xiàn)FA組NLRP3的mRNA表達(dá)水平略高于CON組（P<0.05），NLRP3-/-小鼠FFA組TXNIP

8、、ASC及Caspase-1的mRNA表達(dá)量高于CON組（P<0.05），TXNIP-/-小鼠FFA組NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA表達(dá)量較CON組顯著增高（P<0.01）。
　?。?）WT小鼠FFA組TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量較CON組明顯增高（P<0.05），NLRP3-/-小鼠FFA組TXNIP、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量與CON組相比無顯著性差異（P>0.0

9、5），TXNIP-/-小鼠FFA組NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量較CON組顯著增高（P<0.05）。
　　（5）激光共聚焦結(jié)果示W(wǎng)T小鼠FFA組KCs中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的熒光強(qiáng)度較CON組明顯增高，TXNIP-/-小鼠FFA組NLRP3及Caspase-1的熒光強(qiáng)度較CON組亦明顯升高，NLRP3-/-小鼠FFA組TXNIP及Caspase-1的熒光強(qiáng)度較CON組僅輕度升高。
　

10、?。?）WT及TXNIP-/-小鼠FFA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平較CON組明顯增高（P<0.05），NLRP3-/-小鼠FFA組IL-1β的水平較CON組僅輕度增高，兩組比較無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：FFA可激活WT及TXNIP-/-小鼠KCs中NLRP3炎癥小體，促進(jìn)KCs分泌IL-1β，敲除小鼠NLRP3基因后可明顯抑制FFA刺激導(dǎo)致的KCs中NLRP3炎癥小體的激活及IL-1β的分泌。
　　第三

11、部分：抑制TXNIP與NLRP3基因的表達(dá)對(duì)小鼠單純性脂肪肝及脂肪性肝炎形成的影響
　　目的：通過建立NAFL與NASH小鼠模型，探討TXNIP與NLRP3炎癥小體在小鼠NAFL與NASH形成過程中的作用。
　　方法：分別用普通飼料（ND）及蛋氨酸膽堿缺乏的飼料（MCD）飼料喂養(yǎng)WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠四周，用高脂飼料（HFD）喂養(yǎng)WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠八周。每周稱小

12、鼠體重，喂養(yǎng)結(jié)束后稱肝臟重量，檢測小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶、FFA及IL-1β的水平，蘇木素伊紅染色法（HE染色）及油紅染色法觀察肝組織病理變化，透射電鏡觀察WT小鼠肝組織的形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)法觀察F4/80在肝組織中的表達(dá)情況，激光共聚焦檢測肝組織中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表達(dá)情況。提取各組小鼠KCs，Western blotting檢測TXNIP、NLRP3、ASC及 Caspase-1的蛋白表達(dá)水平，免疫共沉淀技術(shù)

13、檢測 TXNIP、NLRP3、ASC及 Caspase-1的相互作用情況。
　　結(jié)果：
　?。?）WT小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD組血清ALT及AST較ND組明顯增高（P<0.05），HFD組較ND組僅輕度增高，無顯著性差異（P>0.05）；WT小鼠HFD組與MCD組血清FFA水平較ND組明顯增高（P<0.05），NLRP3-/-小鼠與TXNIP-/-小鼠各組血清中FFA水平無顯著性差異（P>0.0

14、5）；WT小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD組血清IL-1β水平明顯高于ND組及HFD組（P<0.01），NLRP3-/-小鼠MCD組血清IL-1β水平較ND組及HFD組僅輕度增高，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（2）WT小鼠及TXNIP-/-小鼠HE染色及油紅染色示HFD組NAFL形成，肝細(xì)胞有脂肪變，炎癥不明顯，氣球樣變少見，MCD組NASH形成，肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死，有較多炎癥細(xì)胞浸潤，MCD組肝臟F4/80表達(dá)陽性

15、細(xì)胞（KCs）較ND組及HFD組明顯增多。WT小鼠肝組織透射電鏡結(jié)果示MCD組肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)有較多脂滴，伴有肝細(xì)胞壞死，部分肝血竇被破壞，紅細(xì)胞進(jìn)入肝細(xì)胞間隙。NLRP3-/-小鼠 HFD組亦有NAFL形成，肝細(xì)胞脂肪變，肝血竇壓縮變窄，炎癥細(xì)胞浸潤較少，MCD組肝細(xì)胞壞死及炎癥程度較輕，未形成典型NASH，MCD組肝臟F4/80表達(dá)陽性細(xì)胞（KCs）與HFD組相比無明顯增多。
　　（3）肝組織激光共聚焦結(jié)果示W(wǎng)T小鼠MCD組

16、TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表達(dá)水平較ND組明顯增高，TXNIP-/-小鼠MCD組NLRP3及Caspase-1的表達(dá)水平較ND組亦明顯增高，NLRP3-/-小鼠MCD組TXNIP及Caspase-1的表達(dá)水平較ND組僅輕度增高。
　?。?）Western blotting結(jié)果示W(wǎng)T小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD組KCs中NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)水平較ND組及HFD組明顯增高（P<0.05）

17、，ND組與HFD組之間無顯著性差異（P>0.05）。NLRP3-/-小鼠MCD組ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量與ND組及HFD組相比無顯著性差異（P>0.05）。
　?。?）免疫共沉淀結(jié)果示W(wǎng)T小鼠MCD組KCs中NLRP3炎癥小體共聚體的量較ND組及HFD組明顯增多（P<0.05），ND組及HFD組間無顯著性差異（P>0.05），KCs中TXNIP亦可與NLRP3形成共聚體，MCD組TXNIP的表達(dá)量較ND組及HFD組僅

18、輕度增加，比較無顯著性差異（P>0.05）；TXNIP-/-小鼠MCD組KCs中仍可形成NLRP3炎癥小體共聚體，共聚體的量較 ND組明顯增多（P<0.05）；NLRP3-/-小鼠MCD組KCs中仍有少量ASC-Caspase-1共聚體形成，共聚體的量較ND組僅輕度增加（P>0.05）。
　　結(jié)論：FFA可通過激活KCs中NLRP3炎癥小體，促進(jìn)KCs分泌IL-1β，誘導(dǎo)WT小鼠NASH形成，敲除小鼠TXNIP基因并不能阻止NAS