化瘀解毒中藥調(diào)控NLRP3炎癥小體信號(hào)通路抑制細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：化瘀解毒中藥對(duì)梗阻性腎病大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤和炎性因子表達(dá)的影響
　　目的：觀察梗阻性腎病模型大鼠一般情況、腎臟病理改變、梗阻側(cè)腎臟炎性細(xì)胞浸潤等，同時(shí)觀察血液及梗阻側(cè)腎臟白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等炎性因子變化，探索化瘀解毒中藥對(duì)梗阻性腎病大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子表達(dá)的影響，為化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、r>　　方法：
　　1.動(dòng)物分組和模型制備：40只SD雄性大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（UUO）組、依普利酮（EPL）組及中藥（TCM）組，每組10只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)復(fù)制梗阻性腎病大鼠模型。假手術(shù)組僅游離而不結(jié)扎輸尿管。
　　2.藥物干預(yù)：術(shù)后經(jīng)口給藥， EPL組大鼠給予依普利酮100mg/（kg·d）；TCM組給予化瘀解毒中藥煎劑13.7g/（kg·d）；Sham組及UUO組給予等容量生理鹽

3、水。每天1次，連續(xù)10天。干預(yù)結(jié)束后斷頭取血，摘取左側(cè)腎臟，部分組織多聚甲醛固定，其余組織-70℃保存。
　　3.檢測指標(biāo)與方法：觀察大鼠一般狀況；記錄飲水量及進(jìn)食量；測量24h尿量；稱取體質(zhì)量、梗阻側(cè)腎質(zhì)量，并計(jì)算腎臟指數(shù)（KI）；全自動(dòng)生化分析儀檢測血清肌酐（SCr）、尿肌酐（UCr）、血清尿素（SUr），并計(jì)算肌酐清除率（Ccr）；HE染色觀察腎組織炎性細(xì)胞浸潤；SABC法檢測腎臟巨噬細(xì)胞 F4/80的表達(dá)；放射免疫法檢測血

4、清 IL-1β、IL-18、TNF-α含量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清 MCP-1含量；Real time-PCR檢測腎臟IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)；SABC法和Western blot檢測IL-1β蛋白表達(dá)。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用（x±S）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　

5、　1.各組大鼠一般情況、體質(zhì)量、腎質(zhì)量及KI比較：Sham組進(jìn)食量、飲水量穩(wěn)定，體質(zhì)量增長穩(wěn)定，反應(yīng)敏捷。各造模組大鼠進(jìn)食量、飲水量均有所下降，體質(zhì)量增長緩慢，反應(yīng)能力減弱。UUO術(shù)后10天，與Sham組相比，UUO組大鼠體質(zhì)量下降（P＜0.05）、梗阻側(cè)腎臟增大，腎質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）、梗阻側(cè)KI亦明顯上升（P＜0.01）；與UUO組相比， EPL組及TCM組大鼠的梗阻側(cè)腎質(zhì)量明顯下降（P＜0.05）、體質(zhì)量有所增加、梗阻側(cè)K

6、I亦有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.各組大鼠腎功能比較：與Sham組相比，UUO組SCr、SUr未見明顯升高，Ccr未見明顯降低（P＞0.05）；與UUO組相比，EPL組及TCM組各指標(biāo)未見明顯變化（P＞0.05）。
　　3.各組大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤情況比較：HE染色顯示，Sham組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)基本正常，腎間質(zhì)偶見炎性細(xì)胞浸潤；UUO組大鼠輸尿管擴(kuò)張，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯增多，腎小管上皮細(xì)胞變性、濁

7、腫甚至壞死；EPL組及TCM組大鼠輸尿管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞亦有變性與濁腫，但炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。
　　4.各組大鼠腎組織 F4/80表達(dá)比較：Sham組大鼠腎間質(zhì)僅見少量F4/80陽性細(xì)胞；UUO組F4/80陽性細(xì)胞浸潤明顯增多，主要表達(dá)于髓質(zhì)；EPL及中藥組可見到陽性細(xì)胞，但較UUO組明顯減少。
　　5.各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α及MCP-1含量比較：與Sham組大鼠比較，UUO組血清IL-1β、I

8、L-18、TNF-α、MCP-1含量明顯升高（P＜0.01）；與UUO組大鼠比較，EPL組血清IL-1β、TNF-α、MCP-1含量明顯降低（P＜0.01）、IL-18亦有下降趨勢（P＞0.05）；與UUO組大鼠比較，TCM組血清IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P＜0.01），MCP-1含量降低（P＜0.05），IL-18含量亦有下降趨勢（P＞0.05）。
　　6.各組大鼠腎臟IL-1β、TNF-α、MCP-1 mRNA表達(dá)比

9、較：與Sham組大鼠比較，UUO組腎組織IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與UUO組大鼠比較，EPL組和TCM組腎組織IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。
　　7.SABC法檢測各組大鼠腎臟IL-1β蛋白表達(dá)比較：Sham組腎組織IL-1β呈弱表達(dá)，UUO組IL-1β主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿。與Sham組大鼠比較，UUO組腎組織IL-1β表達(dá)明顯增強(qiáng)；與UUO組大鼠比較

10、， EPL組和TCM組腎組織IL-1β表達(dá)明顯減弱。
　　8.Western Blot法檢測各組大鼠腎臟IL-1β蛋白表達(dá)比較：UUO組大鼠腎組織IL-1β表達(dá)明顯高于Sham組（P＜0.01）；與UUO組大鼠比較，EPL組和TCM組腎組織IL-1β表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。
　　第二部分：化瘀解毒中藥對(duì)梗阻性腎病大鼠腎臟細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）及NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響
　　目的：觀察梗阻性腎病模

11、型大鼠腎臟NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡改變；觀察化瘀解毒中藥對(duì)梗阻性腎病時(shí) NLRP3-Caspase-1-IL-1β軸以及NLRP3-Caspase-1-Pyroptosis通路的影響；同時(shí)探討梗阻性腎病NF-κB與NLRP3信號(hào)通路的關(guān)系以及化瘀解毒中藥的影響；從而明確化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的分子機(jī)制，并尋找其作用靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物分組、模型制備及藥物干預(yù)方法同第一部分。
　　2.檢測指標(biāo)與方法：TUN

12、EL染色檢測腎臟組織細(xì)胞DNA損傷情況；HE染色觀察腎臟損傷細(xì)胞的形態(tài)；Real time-PCR檢測腎臟 NLRP3、Caspase-1、 IL-1β及 NF-κB mRNA表達(dá)；SABC法檢測腎臟 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β蛋白表達(dá)并定位；Western blot法檢測腎臟NLRP3、Caspase-1、 IL-1β及NF-κB蛋白表達(dá)并定量。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.

13、各組大鼠腎臟組織細(xì)胞TUNEL染色陽性率比較：Sham組僅見少量TUNEL陽性細(xì)胞。與Sham組比較，UUO組細(xì)胞陽性率升高，以髓質(zhì)擴(kuò)張的遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞為主（P＜0.01）。與UUO組比較，EPL組和TCM組的遠(yuǎn)端小管TUNEL陽性細(xì)胞減少，陽性率降低（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2.UUO誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞損傷表現(xiàn)為多種病理形態(tài)：胞核固縮或斷裂，胞膜無明顯變化，為凋亡（Apoptosis）細(xì)胞形態(tài)特征；胞核固縮或斷裂，胞漿

14、腫脹，胞膜不完整，為焦亡（Pyroptosis）細(xì)胞形態(tài)特征；胞核腫脹或溶解，胞漿腫脹，胞膜不完整，為壞死（Necrosis）細(xì)胞形態(tài)特征。
　　3.各組大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)比較：與Sham組比較，UUO組腎臟NLRP3、Caspase-1表達(dá)升高（P＜0.01）。與UUO組比較，EPL組及TCM組NLRP3、Caspase-1表達(dá)降低（P＜0.01）。
　　4.SABC法檢測UUO大鼠腎臟N

15、LRP3、Caspase-1分子蛋白表達(dá)：Sham組NLRP3表達(dá)不明顯，UUO組表達(dá)顯著增強(qiáng)，主要表達(dá)于腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞，EPL組及TCM組表達(dá)較UUO組顯著減弱。Sham組Caspase-1呈弱表達(dá)，UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要見于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，EPL組及TCM組較UUO組顯著減弱。
　　5.Western blot檢測UUO大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1分子蛋白表達(dá)：Sham組NLRP3、Caspa

16、se-1分子均呈弱表達(dá)，UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），EPL組及TCM組表達(dá)較UUO組明顯減弱（P＜0.01）。
　　6.各組大鼠腎臟IL-1β分子mRNA及蛋白表達(dá)：見第一部分。
　　7.各組大鼠腎臟NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)：與Sham組比較，UUO組腎臟NF-κB mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）。與UUO組比較，EPL組及TCM組NF-κB mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯

17、示，Sham組大鼠腎臟NF-κB（p65）呈弱表達(dá)，UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）， EPL組及TCM組表達(dá)較UUO組明顯減弱（P＜0.01）。
　　第三部分：化瘀解毒中藥含藥血清對(duì) mDCT細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）及NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響
　　目的：觀察醛固酮誘導(dǎo)的mDCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB的表達(dá)情況，同時(shí)觀察mDCT細(xì)胞DNA損傷及膜損傷情況；以探索化瘀解毒

18、中藥對(duì) mDCT細(xì)胞 NF-κB-NLRP3-Caspase-1-IL-1β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞焦亡的影響；從而進(jìn)一步明確化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的分子機(jī)制及其作用靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.含藥血清制備：10只SD大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組與中藥組，每組5只。中藥組給予化瘀解毒中藥煎劑13.7g/（kg? d）；對(duì)照組給予等容量生理鹽水。每天1次，連續(xù)10天。末次給藥1h后腹主動(dòng)脈采血，分離血清。
　　2.細(xì)胞培

19、養(yǎng)：腎小管上皮細(xì)胞mDCT培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液（含10％～20%胎牛血清，青霉素和鏈霉素各100單位/ml）中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔日換液，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，制成單細(xì)胞懸液（4×104個(gè)/ml），接種于6孔板培養(yǎng)或分瓶培養(yǎng)24小時(shí)，換成無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步化，而后加藥刺激24小時(shí)，收集細(xì)胞或上清液。
　　3.細(xì)胞分組：培養(yǎng)細(xì)胞分為五組：對(duì)照（Cont）組、醛固酮（ALD）

20、組、依普利酮加醛固酮（EPL+ALD）組、正常血清加醛固酮（NS+ALD）組和含藥血清加醛固酮（DS+ALD）組。Cont組加入無藥培養(yǎng)液；其他各組均加入含1μM（終濃度）醛固酮的培養(yǎng)液；EPL+ALD組加入10μM（終濃度）的依普利酮作用30分鐘后再加入醛固酮培養(yǎng)液；NS+ALD組加入10%（終濃度）正常血清；DS+ALD組加入10%（終濃度）含藥血清。Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組：對(duì)照（Cont）組、醛固酮（ALD）組、

21、依普利酮（EPL）組、中藥（TCM）組。Cont組加入無藥培養(yǎng)液；其他各組均加入含1μM（終濃度）醛固酮的培養(yǎng)液；EPL組加入10μM（終濃度）的依普利酮作用30分鐘后再加入醛固酮培養(yǎng)液；TCM組加入10%（終濃度）含藥血清；Cont、ALD及EPL組均加入10%（終濃度）正常血清。
　　4.檢測指標(biāo)與方法：采用免疫熒光染色/激光共聚焦顯微系統(tǒng)檢測醛固酮誘導(dǎo)的mDCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達(dá)情況；乳酸脫

22、氫酶（LDH）實(shí)驗(yàn)檢測mDCT細(xì)胞的膜損傷情況；TUNEL染色檢測mDCT細(xì)胞的DNA損傷情況；Western blot檢測mDCT細(xì)胞NLRP3、Caspase1、IL-1β及NF-κB（p65）的表達(dá)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光染色/激光共聚焦顯微系統(tǒng)檢測 mDCT細(xì)胞 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達(dá)：DAPI使mDCT細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，NLRP3、Casp

23、ase-1及 IL-1β分子主要表達(dá)于細(xì)胞漿，呈橘紅熒光。結(jié)果證實(shí)經(jīng)醛固酮刺激后，細(xì)胞可見NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達(dá)。
　　2.各組mDCT細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH含量比較：ALD組mDCT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量明顯高于Cont組（P＜0.01）；與ALD組比較，EPL+ALD組LDH含量明顯降低（P＜0.01）；DS+ALD組LDH含量低于NS+ALD組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.各組 mDCT細(xì)胞

24、TUNEL染色陽性率比較：ALD組 mDCT細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞增多，高于Cont組（P＜0.01）；與ALD組比較，EPL+ALD組TUNEL陽性率降低（P＜0.05）；與NS+ALD組比較，DS+ALD組TUNEL陽性率降低（P＜0.05）。
　　4.各組mDCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達(dá)：與Cont組比較，ALD組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與AL

25、D組比較，EPL組及TCM組表達(dá)明顯減弱（P＜0.01）。
　　5.各組mDCT細(xì)胞NF-κB（p65）表達(dá)：Cont組細(xì)胞NF-κB分子均呈弱表達(dá)，ALD組表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），EPL組及 TCM組表達(dá)較ALD組減弱（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.炎性損傷在梗阻性腎病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1等炎性因子參與這一過程。
　　2.細(xì)胞焦亡（Pyroptosi

26、s）是梗阻性腎病的重要病理改變，與NLRP3活化相關(guān)，通過NLRP3-Caspase-1-IL-1β/Pyroptosis通路誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。
　　3.化瘀解毒中藥減輕梗阻性腎病炎性損傷的機(jī)制與其下調(diào) NLRP3表達(dá)而抑制炎性因子分泌、并抑制Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。
　　4.炎性細(xì)胞浸潤、炎性因子增多分別是腎病“濁毒”形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)、分子基礎(chǔ)之一；NF-κB-NLRP3-Caspase-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腎病“濁