依魯替尼對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和焦亡的調(diào)節(jié)作用及其與NLRP3炎癥小體關(guān)系的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化早期,單核細(xì)胞在趨化因子的作用下被招募至病變處,與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,隨后遷移至內(nèi)皮下,轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞攝入ox-LDL(oxidizedlow-density lipoprotein,氧化低密度脂蛋白)形成泡沫細(xì)胞,并大量死亡,形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的壞死核心,削弱纖維帽,增加斑塊不穩(wěn)定性。巨噬細(xì)胞的泡沫化和死亡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　近年來NLRP3(nucleotide-binding olig

2、omerization domain-like receptor protein3,核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3)炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用越來越受到重視。研究顯示NLRP3炎癥小體參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成,并與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)。NLRP3炎癥小體可被ox-LDL激活,激活的炎癥小體可剪切caspase-1前體(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1),促進(jìn)成熟I

3、L-1β(Interleukin-1β,白介素1β)的釋放,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡,還可能參與細(xì)胞脂質(zhì)沉積。
　　依魯替尼是一種口服的BTK(Bruton's tyrosine kinase,布魯頓酪氨酸激酶)抑制劑,臨床上被用來治療白血病。研究發(fā)現(xiàn)依魯替尼可抑制明礬誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活,尚不知其對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活是否同樣有抑制作用。據(jù)此提出假說:依魯替尼可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活調(diào)節(jié)ox

4、-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和焦亡。
　　目的:觀察依魯替尼對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1起源巨噬細(xì)胞泡沫化和焦亡的影響,探討其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。
　　方法:以PMA誘導(dǎo)的THP-1或THP-1-defNLRP3起源巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。給予ox-LDL,構(gòu)建細(xì)胞泡沫化、焦亡、遷移和黏附模型,并分別用依魯替尼和MCC950(NLRP3特異性抑制劑)進(jìn)行處理。采用Western Blot、ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞NL

5、RP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1、IL-1β水平,觀察ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活的誘導(dǎo)作用,以及依魯替尼對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活的影響。采用油紅O染色、酶學(xué)法、免疫熒光、流式等方法觀察依魯替尼對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化、細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量、脂質(zhì)攝入及膽固醇外流的影響,并采用Western Blot方法檢測(cè)依魯替尼對(duì)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇平衡的關(guān)鍵蛋白水平的影響,及其與N

6、LRP3炎癥小體的關(guān)系。分別用依魯替尼、MCC950、VX765(caspase-1特異性抑制劑)等處理巨噬細(xì)胞,進(jìn)行乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)、Hoechst33342和碘化丙啶雙染及TUNEL染色,驗(yàn)證ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的誘導(dǎo)作用,觀察依魯替尼對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡的影響,以及其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。采用transwell小室、劃痕實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)觀察依魯替尼對(duì)單核巨噬細(xì)胞遷移、黏附的影響及其與NLRP3炎癥小體的

7、關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　(1)依魯替尼可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1起源的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活。
　　(2)依魯替尼、MCC950和NLRP3基因敲除均可以調(diào)節(jié)THP-1起源的巨噬細(xì)胞CD36、ABCA1和SR-BI蛋白表達(dá)水平,抑制細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝入,促進(jìn)游離膽固醇外流,減輕細(xì)胞泡沫化程度。
　　(3)Ox-LDL可促進(jìn)THP-1起源巨噬細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放,增加PI染色細(xì)胞比率及TUNE