棉酚通過非經(jīng)典炎癥小體通路誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡.pdf

1、目的：棉酚(Gossypol,GOS)是從棉籽中分離提取的黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，具有抗真菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性，但關(guān)于其對炎癥小體活性影響方面的研究未見報道。本課題利用細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide。LPS）激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以及RAW264.7細(xì)胞系，檢測GOS對巨噬細(xì)胞中炎癥小體活化的影響，探討GOS激活巨噬細(xì)胞炎癥小體通路的作用機制，為深入研究GOS對固有免疫細(xì)胞的藥理和毒理作用提供實驗依據(jù)。

2、
　　方法：
　　1.通過腹腔注射3％巰基乙酸鹽（Thioglycollate，TG）誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的大量產(chǎn)生。
　　2.采用碘化丙錠（Propidium iodide，PI）染色法，測定GOS對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　3.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測GOS對LPS刺激或未刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中炎癥小體通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。
　　4.采用流式微球捕獲蛋白定量技術(shù)(Cyt

3、ometric beads array,CBA)檢測GOS對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β的蛋白水平的影響。
　　5.利用大腸桿菌DH5α活菌腹腔注射，建立小鼠細(xì)菌性敗血癥模型，檢測GOS對細(xì)菌性敗血癥小鼠存活率的影響。
　　結(jié)果：
　　1. GOS能劑量依賴性和時間依賴性地引起經(jīng)LPS激活或未刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生死亡，且低濃度（<5μM）時對細(xì)胞的毒性較低，高濃度（>5μM）時對細(xì)胞顯示出較

4、大的毒性。與ATP處理的細(xì)胞相似，GOS引起的細(xì)胞死亡伴隨急劇細(xì)胞膜破裂和HMGB1及pro-caspase11的釋放，提示該死亡是細(xì)胞焦亡。
　　2.GOS能誘導(dǎo)ASC缺失的RAW264.7細(xì)胞發(fā)生焦亡。
　　3.GOS能誘導(dǎo)大量HMGB1、pro-IL-1β及pro-caspase-11從LPS刺激的巨噬細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中，但僅能誘導(dǎo)低水平的成熟IL-1β的分泌。
　　4.泛caspase和caspase-1亞家族

5、抑制劑均能強烈地抑制焦亡的發(fā)生，但caspase-3抑制劑不能。非特異性細(xì)胞保護劑甘氨酸可以衰減GOS誘導(dǎo)的焦亡，而其他經(jīng)典的焦亡抑制劑（包括氯化鉀和N-乙酰半胱氨酸）可以抑制ATP誘導(dǎo)的焦亡，但對GOS誘導(dǎo)的焦亡不但沒有抑制反而有增強作用。這些結(jié)果說明，GOS可能通過非經(jīng)典炎癥小體通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡。
　　5.體內(nèi)實驗顯示，GOS能清除TG引出的腹腔巨噬細(xì)胞，并大量募集其它的免疫細(xì)胞，加重小鼠細(xì)菌性敗血癥，顯著降低細(xì)菌感染模型