細(xì)胞自噬對oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡(pyroptosis)的影響及機(jī)制.pdf

1、背景及目的:細(xì)胞焦亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡方式,其生物學(xué)特征是依賴于半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)的死亡方式并伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生。最近的研究發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的重要功能分子caspase-1與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　Caspase-1的重要功能之一是介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞等受到病原體感染或內(nèi)源性因素刺激后引起的細(xì)胞焦亡;同時,

2、把白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)前體裂解成具有活性的IL-1β,而后者等能募集、激活其他免疫細(xì)胞,誘導(dǎo)其它炎癥因子、趨化因子、粘附分子等的合成,它們級聯(lián)放大了炎癥反應(yīng),促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　自噬是真核細(xì)胞所共有的一種降解胞內(nèi)異?；蜻^多的細(xì)胞器、蛋白等來維持細(xì)胞正常功能的機(jī)制。自噬可利用其雙層的膜結(jié)構(gòu)將要降解的細(xì)胞器或蛋白等進(jìn)行包裹,形成自噬體,自噬體隨后與溶酶體融合,將這些底物進(jìn)行降解。缺乏自

3、噬會導(dǎo)致膽固醇晶體在斑塊中的聚集以及NACHT決定域,亮氨酸重復(fù)序列,pyrin決定域蛋白-3（NOD-,LRR-,and pyrin domain[PYD]-containing protein3,NLRP3)炎癥小體的活化,從而加重了動脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程?；钚匝醮?reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與細(xì)胞焦亡關(guān)系密切,可以活化caspase-1,引起細(xì)胞焦亡。自噬在炎癥體及caspase-1的活化中發(fā)揮

4、重要作用。
　　他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,此類藥物表現(xiàn)出多效性,包括改善內(nèi)皮功能,促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定,減少氧化應(yīng)激和炎癥,抑制血栓的形成。最近研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以提高某些組織細(xì)胞的自噬水平。但其對氧化的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡的影響以及產(chǎn)生影響的可能途徑及相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚。
　　本研究擬通過建

5、立oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)聚集的模型,觀察脂質(zhì)聚集的巨噬細(xì)胞在辛伐他汀作用后細(xì)胞自噬及焦亡發(fā)生情況及可能的作用機(jī)制,探討他汀類藥物在oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)聚集過程中的作用,為尋找藥物作用新途徑及提供新的臨床治療思路提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:oxLDL作用于J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞,采用油紅O染色法檢測細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集情況;細(xì)胞焦亡的檢測采用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放試劑盒檢測LDH

6、的釋放;熒光顯微鏡觀察丫啶橙(Acridine orange,AO)、溴化乙錠(Ethidium Bromide,EB)的染色情況;Western-blot檢測pro-caspase-1、cleaved caspase-1和IL-1β的表達(dá)情況;加入辛伐他汀藥物作用后,檢測上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化情況;采用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)染色流式細(xì)胞儀檢測辛

7、伐他汀作用前后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平;采用western-blot檢測辛伐他汀作用前后LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1的表達(dá)情況;激光共聚焦觀察LC3-GFP熒光聚集情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了 oxLDL誘導(dǎo)脂質(zhì)聚集的巨噬細(xì)胞的模型;油紅 O染色結(jié)果表明,oxLDL作用于巨噬細(xì)胞后可導(dǎo)致脂質(zhì)聚集,并呈明顯的劑量依賴;OxLDL作用于巨噬細(xì)胞后,LDH的釋放顯著增加由(18.04±3.57)％增加到(62.4±7.32)%;AO EB

8、的復(fù)染中,橘紅色的熒光所占百分比顯著增加由(6±4)%增加到(65±3)%,提示細(xì)胞膜出現(xiàn)不完整的情況增多;Western-blot檢測caspase-1和IL-1β的表達(dá)呈增高的趨勢;加入辛伐他汀藥物作用后,油紅O染色結(jié)果表明脂質(zhì)聚集情況減少,總膽固醇檢測顯示細(xì)胞內(nèi)總膽固醇有減少的趨勢,細(xì)胞焦亡檢測結(jié)果:LDH釋放減少,AO EB染色結(jié)果顯示橘紅色的熒光有所占百分比減少趨勢,EB染色陽性(橘紅色)細(xì)胞減少至(35±7)%,wester

9、n-blot檢測活化 caspase-1和成熟 IL-1β的表達(dá)明顯降低。細(xì)胞自噬檢測結(jié)果:Western-blot結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)與單一加入oxLDL作用的巨噬細(xì)胞相比增加明顯;激光共聚焦顯微鏡結(jié)果也表明辛伐他汀可顯著增加GFP-LC3熒光聚集體的形成。DCFH-DA染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果:oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS,在辛伐他汀作用后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低至(139±0.97)%,應(yīng)用3-MA自噬抑制劑