多氯聯(lián)苯醌誘導細胞發(fā)生自噬以及自噬-凋亡轉(zhuǎn)換的機制分析.pdf

1、多氯聯(lián)苯（PCBs）是一類無所不在的持久性有機污染物，由于其多種毒性效應如內(nèi)分泌毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性等，在二十世紀七十年代已被禁止使用，但是由于其特殊的理化及生物學特性，PCBs仍然廣泛存在于我們的環(huán)境包括陸地和水生系統(tǒng)。細胞自噬是細胞內(nèi)受損衰老的蛋白質(zhì)或者細胞器包裹起來形成自噬體，自噬體再與溶酶體融合進而進行消化降解的過程，也常被作為細胞的自我保護機制。該研究的目的是為了分析PCB29-pQ激活自噬的具體機制，以及探討細胞自噬與細

2、胞凋亡間的轉(zhuǎn)換機制。本研究分為三個部分：
　　第一部分：研究考察了多氯聯(lián)苯醌通過mTOR/p70S6k誘導細胞自噬發(fā)生的分子機制。選用 HepG2和 MDA-MB-231細胞作為研究對象，并通過實驗發(fā)現(xiàn)PCB29-pQ誘導的自噬沒有細胞特異性。首先，兩種細胞在5μM PCB29-pQ處理24 h后透射電鏡檢測細胞超微結(jié)構(gòu)顯示出自噬泡顯著特征，并通過AO染色、MDC染色觀察到明顯的自噬泡形成，由此先從形態(tài)學和生化特征表明 PCB29

3、-pQ作用后可以引起細胞發(fā)生自噬。然后從自噬體形成的3個階段證明誘導自噬發(fā)生的分子機制。第一階段從濃度和時間梯度上分別檢測了對自噬開關負調(diào)控的蛋白mTOR和p70S6k的表達，在PCB29-pQ作用后其蛋白表達水平降低，表明激活了自噬的誘導階段。第二階段檢測了自噬體形成過程中自噬相關蛋白 ATG5、ATG12、LC3的表達，并用 RT-PCR分析 LC3 mRNA水平。與對照組相比， PCB29-pQ處理的細胞蛋白和基因的表達水平都顯著

4、增加，且在5μM PCB29-pQ處理24 h有最大值。而自噬降解底物 p62蛋白水平隨時間梯度降低，在5μM PCB29-pQ處理24 h表達水平最低。這些結(jié)果說明PCB29-pQ能夠激活自噬體的形成階段，促進自噬體降解底物的能力。第三階段通過加入CQ抑制LC3的降解后檢測LC3表達的凈通量，結(jié)果表明PCB29-pQ作用后提高了LC3凈通量并在5μM PCB29-pQ作用24 h時最明顯。并且通過轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，免疫熒光觀察了

5、自噬體標記LC3與溶酶體標記 LAMP2的共定位，結(jié)果表明促進了自噬體與溶酶體融合的階段。接著闡明了自噬的發(fā)生在 PCB29-pQ誘導細胞毒性中的作用，在加入不同階段自噬抑制劑3-MA和CQ后，通過CCK8、流式細胞儀、細胞凋亡標志蛋白 caspase3的檢測，表明抑制自噬促進了 PCB29-pQ誘導的細胞毒性的增加。最后用加入ROS清除劑NAC的方法考察PCB29-pQ引起自噬水平升高的原因，結(jié)果表明，PCB29-pQ誘導的細胞自噬的

6、激活受ROS水平的調(diào)節(jié)。根據(jù)以上研究可知，PCB29-pQ可以誘導HepG2和MDA-MB-231細胞發(fā)生自噬，并受細胞內(nèi) ROS水平的調(diào)節(jié)。PCB29-pQ引起的自噬受mTOR/p70S6k和ATG5/ATG12/LC3信號通路的調(diào)控，且作為一種存活機制保護細胞。
　　第二部分：探討了多氯聯(lián)苯醌在低濃度誘導自噬，高濃度誘導凋亡時，鈣蛋白酶活性的作用對自噬向凋亡信號傳遞的影響。首先通過JC-1熒光探針檢測 HepG2細胞線粒體膜電

7、位，免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白caspase9/caspase3等表達，TUNEL法檢測細胞凋亡，免疫熒光檢測自噬標志蛋白LC3焦點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，隨著 PCB29-pQ處理濃度的升高細胞凋亡水平逐漸增加，而在低濃度5μM PCB29-pQ處理后自噬LC3焦點最多，隨著濃度升高，自噬LC3焦點數(shù)目降低。隨后用流式細胞儀檢測PCB29-pQ誘導的細胞鈣離子水平的變化，熒光分光光度計檢測鈣蛋白酶活性，結(jié)果表明，PCB29-pQ可以

8、誘導HepG2細胞鈣離子水平以及鈣蛋白酶活性的升高，以及在加入鈣離子螯合劑BAPTA-AM后抑制了calpain蛋白表達，表明，calpain的表達依賴于Ca2+水平的調(diào)節(jié)。文獻報道Beclin1、ATG5可經(jīng)鈣蛋白酶切割形成Beclin1-c、tATG5易位至線粒體將自噬向凋亡信號傳遞，而在本研究中 PCB29-pQ沒有引起 Beclin1、ATG5切割易位至線粒體。
　　第三部分：探討了多氯聯(lián)苯醌誘導細胞自噬與細胞凋亡轉(zhuǎn)換的機

9、制，分析選取了對自噬和凋亡有雙重調(diào)節(jié)作用的 p53/HMGB1蛋白。Western Blot和免疫熒光實驗表明了PCB29-pQ作用后誘導HepG2細胞p53/HMGB1易位到細胞質(zhì)。免疫共沉淀實驗表明了5μM PCB29-pQ作用后促進了 HepG2細胞p53/HMGB1在細胞核中的結(jié)合，15μM PCB29-pQ作用后促進了 HepG2細胞p53/HMGB1在細胞質(zhì)中的結(jié)合。由于HMGB1/p53可以作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因的表

10、達，影響細胞自噬與凋亡。我們干擾了 p53蛋白表達后檢測了 p53下游靶基因 DRAM、ULK1、Bax表達，同時干擾了 HMGB1蛋白表達后 Western Blot檢測了HMGB1的下游蛋白HSPB1表達，結(jié)果表明，在抑制了p53/HMGB1的作用后，抑制了該蛋白調(diào)控的靶基因的表達。針對上述檢測結(jié)果，我們進一步研究p53/HMGB1誘導細胞自噬和細胞凋亡的作用機制。干擾p53基因后提取了核質(zhì)蛋白，Western Blot表明p53

11、siRNA后促進了PCB29-pQ誘導的HMGB1進一步易位至細胞質(zhì)，細胞存活率實驗表明了p53 siRNA抑制了PCB29-pQ誘導的細胞凋亡，免疫熒光 LC3焦點實驗表明 p53 siRNA促進了 PCB29-pQ誘導的細胞自噬，而在加入HMGB1抑制劑EP后，細胞凋亡增加，細胞自噬水平降低。這些結(jié)論表明，易位到細胞質(zhì)中的 HMGB1發(fā)揮著抑制凋亡、促進自噬的作用。在干擾了HMGB1蛋白后相同的實驗方法證明HMGB1 siRNA后促