芍藥苷誘導增生性瘢痕成纖維細胞自噬的發(fā)生.pdf

1、自噬是真核細胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，自噬發(fā)生的重要特征為自噬體合成的增加，伴隨著LC3-I（微管相關蛋白-輕鏈3-I，microtubule-associated protein1 light chain3-I）向LC3-II（微管相關蛋白-輕鏈3-II，microtubule-associated protein1 light chain3-II）的轉化的增加，因此，LC3-II/LC3-I的比值是評價自噬發(fā)生及自噬水平高低的一個重要

2、指標。研究發(fā)現(xiàn)心臟、肺臟、腎臟等纖維化疾病中存在自噬不足現(xiàn)象，最近研究表明增生性瘢痕組織自噬相關蛋白LC3和Beclin1表達水平較正常皮膚組織明顯降低。增生性瘢痕病理特征主要表現(xiàn)為成纖維細胞過度增殖和細胞外基質大量合成及沉積，然而增生性瘢痕中成纖維細胞的自噬水平尚不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)自噬的發(fā)生能抑制心、肺、腎等纖維化疾病的纖維化進展，而自噬促進劑能明顯抑制瘢痕成纖維細胞增殖、遷移，并明顯減少α-SMA的表達。芍藥苷（paeoniflo

3、rin，PAE）是傳統(tǒng)中藥芍藥的主要單體活性成分。
　　本課題組前期研究表明芍藥苷能減少增生性瘢痕成纖維細胞中TGF-β1的自分泌和α-SMA的表達，從而抑制增生性瘢痕的發(fā)展，那么芍藥苷是否會影響增生性瘢痕成纖維細胞的自噬發(fā)生？新近研究表明在瘢痕成纖維細胞中基質金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2)的表達增加可引起I型膠原表達的下降，相關研究發(fā)現(xiàn)在腎臟

4、纖維化中TIMP-2表達的增加和自噬的發(fā)生存在正相關關系，而自噬促進劑能有效減少瘢痕成纖維細胞中I型膠原的表達。本課題組前期研究表明芍藥苷能有效減少增生性瘢痕成纖維細胞中I型膠原的分泌，那么芍藥苷能否調節(jié)TIMP-2的表達？是否能通過影響自噬的發(fā)生從而影響TIMP-2的表達？相關研究表明p38MAPK和ERK1/2與增生性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展密切相關，那么p38MAPK和ERK1/2信號轉導通路和芍藥苷影響成纖維細胞自噬的發(fā)生之間是否存在關

5、聯(lián)？
　　目的:探討芍藥苷誘導增生性瘢痕成纖維細胞自噬的發(fā)生
　　方法:（1）收集增生性瘢痕組織及正常皮膚組織，采用組織塊法分離培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞，在不加任何刺激因素的情況下，Western Blot檢測兩種細胞中基礎條件下LC3和TIMP-2的表達情況；（2）分別加入不同濃度（0μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L）的芍藥苷培養(yǎng)24h，Western Blot檢

6、測兩種細胞中LC3、TIMP-2、p-p38MAPK、t-p38MAPK、p-ERK1/2和t-ERK1/2的表達情況；(3)加入400μmol/L的芍藥苷分別培養(yǎng)0h、2h、6h、12h、24h、48h。Western Blot檢測兩種細胞中LC3的表達情況；(4)加入400μmol/L芍藥苷，細胞培養(yǎng)24h，收集細胞，透射電鏡觀察細胞的自噬情況。
　　結果:（1）在不加任何刺激因素的情況下，增生性瘢痕成纖維細胞中LC3-II/

7、LC3-I的比值較正常成纖維細胞明顯降低（P<0.01）；（2）400μmol/L、800μmol/L的芍藥苷能增加增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細胞中LC3-II/LC3-I的比值（P<0.05），而對增生性瘢痕成纖維細胞作用尤為顯著（P<0.01）；（3）增生性瘢痕成纖維細胞中 LC3-II/LC3-I的比值呈時間依賴性增加，24h達高峰；（4）未加任何刺激因素的增生性瘢痕成纖維細胞中未見自噬體和自噬溶酶體，而400μmol/L芍藥苷處

8、理細胞后，細胞胞漿內可見明顯的自噬體和自噬溶酶體；（5）在不加任何刺激因素的情況下，增生性瘢痕成纖維細胞中TIMP-2蛋白的表達量較正常皮膚成纖維細胞明顯升高；（6）增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細胞中 TIMP-2蛋白表達水平隨著芍藥苷濃度的增加呈濃度依賴性增加，其中400μmol/L、800μmol/L芍藥苷對增生性瘢痕成纖維細胞影響顯著（P<0.01）；（7）增生性瘢痕成纖維細胞中p-p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表達較正常皮膚

9、成纖維細胞中升高，而增生性瘢痕成纖維細胞中 p-p38MAPK和 p-ERK1/2蛋白表達在不同濃度芍藥苷刺激后均有升高。
　　結論:（1）增生性瘢痕成纖維細胞的自噬水平較正常成纖維細胞降低；（2）一定濃度的芍藥苷能誘導增生性瘢痕成纖維細胞自噬的發(fā)生；（3）一定濃度的芍藥苷能增加增生性瘢痕成纖維細胞中TIMP-2的表達，而細胞自噬與TIMP-2高表達及膠原降解間的關系，需要進一步研究；（4）一定濃度芍藥苷能增加增生性瘢痕成纖維細胞