C5a對中性粒細(xì)胞自噬-凋亡轉(zhuǎn)換的機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷（ALI）的本質(zhì)是炎癥反應(yīng)和炎癥損傷，而急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）則是其終末狀態(tài)。中性粒細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著至關(guān)重要的作用，其凋亡控制著炎癥反應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度。研究表明：中性粒細(xì)胞是參與MODS與ALI的主要效應(yīng)細(xì)胞，ARDS的病因之一就是PMN凋亡延遲。 自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，貫穿于細(xì)胞生長發(fā)育和生理病理過程。是基本的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程，大部分細(xì)胞都有一定基本水平的自噬，自噬主要降解長壽命蛋

2、白、細(xì)胞器，以維持細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)與功能，90%的蛋白通過自噬路徑降解。自噬過程需要形成一個雙重膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬相關(guān)基因產(chǎn)物5（Atg5）在自噬體形成的過程有重要作用?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)：Atg5被μ-，m-calpain裂解后失去自噬活性，而其氨基端產(chǎn)物tAtg5（truncated-Atg5）靶向線粒體而具有促凋亡活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬/凋亡。 C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)級鏈反應(yīng)的終末產(chǎn)物。C5a通過其受體C5a受體（C5aR）而產(chǎn)生生

3、物學(xué)效應(yīng)，C5aR是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），屬于典型的趨化因子受體家族。C5a為重要的前炎性介質(zhì)，起炎癥啟動和放大作用，參與了許多炎癥性疾病的發(fā)生。C5a通過C5aR影響中性粒細(xì)胞（PMN）內(nèi)calpains活性而趨化PMN，介導(dǎo)PMN脫顆粒、呼吸爆發(fā)及粘附分子的表達(dá)；此外，有研究提示，C5a延遲中性粒細(xì)胞的凋亡，因此考慮C5a對PMN的自噬及凋亡有調(diào)節(jié)作用。 本文擬驗(yàn)證C5a依濃度作用于PMN后，自噬向凋亡轉(zhuǎn)換的作用減弱，

4、細(xì)胞存活時(shí)間延長而凋亡延遲。這對于探討ARDS發(fā)生機(jī)理及治療有重要意義。 方法：采集健康志愿者外周血18ml，肝素抗凝，密度梯度離心法分離，獲得PMN富集層，低滲法破解紅細(xì)胞，重懸細(xì)胞體外培養(yǎng)，共分為8組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：對照組（1，2，3）體外分別培養(yǎng)0、7或24h；實(shí)驗(yàn)組（A、B、C）C5a濃度分別為0.5、1.0和2.0μg/ml刺激組及反義肽干預(yù)組（R4）（C5a濃度1.0μg/ml，反義肽R4濃度10μg/ml），體外均刺激7

5、h，實(shí)驗(yàn)對照組（D）C5a1.0μg/ml刺激24小時(shí)。各組細(xì)胞按計(jì)劃完成刺激后，采用Annexin-Ⅴ法進(jìn)行FITC/PI雙染檢測細(xì)胞的凋亡率。同時(shí)收集各培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞，用Western-blot法檢測細(xì)胞中Atg5，tAtg5的含量。 結(jié)果： 1、 C5a對中性粒細(xì)胞凋亡率的影響 PMN凋亡率依C5a濃度呈下降趨勢，實(shí)驗(yàn)組A、B及C中PMN的凋亡率分別與對照組2相比，均有顯著降低；且A與C組對比差異顯著；

6、對照組2凋亡率顯著低于對照組3點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組D凋亡率與對照組3差異顯著。C5a組與對照組比較，7小時(shí)至24小時(shí)凋亡率增加的幅度變小。 2、體外培養(yǎng)人中性粒細(xì)胞凋亡率及Atg5/tAtg5變化 對照組PMN在0h、7h和24h凋亡率逐漸上升，兩兩比較差異非常顯著，用Western blot對各組細(xì)胞Atg5/tAtg5含量進(jìn)行檢測，相對積分光密度值（RIOD）代表蛋白表達(dá)量的高低。結(jié)果提示：各組均存在Atg5（56kd）和tA

7、tg5（24kd）片段陽性表達(dá)條帶；而各時(shí)間點(diǎn)Atg5逐漸減少，與對照組1比較有顯著性差異；與此相應(yīng)的是tAtg5呈逐漸增加趨勢，對照組3與對照組1比較有顯著性差異，對照組2與對照組1比較有差異。 3、C5a及反義肽對中性粒細(xì)胞凋亡率和Atg5/tAtg5的影響 隨著C5a濃度的增加，Atg5含量也逐漸增加；但實(shí)驗(yàn)組A與對照組2比較無顯著差異，其它各組（實(shí)驗(yàn)組B：1.96±0.06；實(shí)驗(yàn)組C：2.21±0.12）與之比較

8、均有顯著性差異。相反隨著C5a濃度的增加，tAtg5較對照組2（2.13±0.07）含量逐漸減少（實(shí)驗(yàn)組A：1.93±0.95；實(shí)驗(yàn)組B：0.92±0.08；實(shí)驗(yàn)組C：0.65±0.15），實(shí)驗(yàn)組A與對照組2相比差異不明顯，實(shí)驗(yàn)組B組與實(shí)驗(yàn)組B對比有差異，其余各組間對比差異非常明顯。R4組PMN凋亡率較實(shí)驗(yàn)組B比較明顯高，但其仍低于對照組2； Atg5含量對照比實(shí)驗(yàn)組B組明顯減少，tAtg5含量有所增加，但有所矛盾的是R4組與對照組1比